철갑상어 지느러미와 턱뼈 매트릭스에서 코티솔 추출
Summary
이 연구에서는, 우리는 철갑상어 종의 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수준은 ELISA 검소에 선행된 2개의 세척 용매를 비교하여 더 조사되었습니다. 이 연구는 새로운 스트레스 지표로 턱뼈 코티솔의 타당성을 시험.
Abstract
이 연구의 목적은 두 개의 세척 용매 (물과 이소 프로판올)를 사용하여 철갑상어 지느러미에서 코티솔을 추출하는 기술을 개발하고 세 가지 주요 외과 의사 종 중 지느러미 코티솔 수준의 차이를 정량화하는 것입니다. 지느러미는 벨루가7개(후소후소),시베리아 7개(아시펜서바에리이),세브루가 5개(A.stellatus)등 19척의 희생된 철갑상어에서 수확되었다. 철갑상어는 이란 농장에서 2년(2017-2018년)에 자랐으며, 코티솔 추출 분석은 한국에서(2019년 1월~2월) 실시되었습니다. 5 H. 후소에서 턱뼈는 또한 코티솔 추출에 사용되었다. 데이터는 SAS 환경에서 의 일반 선형 모델(GLM) 프로시저를 사용하여 분석하였다. 변이의 인트라-및 인터-분석 계수는 각각 14.15 및 7.70이었다. 간단히, 코티솔 추출 기술은 용매 (초순수 및 이소프로판올)의 3 mL로 시료 (300 ± 10 mg)를 두 번 세척하고, 80rpm에서 2.5 분 동안 회전하고, 7 일 동안 실온 (22-28 °C)에서 세척 된 샘플을 공기 건조하고, 추가 건조를 포함했습니다. 50 Hz에서 비드 비터를 사용하여 32 분 동안 시료를 분말로 분쇄하고 건조 된 분말 (75 ± 5 mg)에 1.5 mL 메탄올을 적용하고, 연속 혼합으로 실온에서 18 시간 동안 느린 회전 (40 rpm)을 적용합니다. 추출 후, 샘플을 원심분리(10분 동안 9,500 x g)하고, 1 mL 상급제를 새로운 미세원심지 튜브(1.5 mL)로 옮겼고, 메탄올을 증발시키기 위해 38°C에서 배양하고, 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 통해 분석하였다. . 종 사이 핀 코 티 솔 수준에서 또는 세척 용매 사이 지 느 러 미와 턱뼈 코 티 솔 수준에서 차이가 관찰 되었다. 이 연구의 결과는 철갑상어 턱뼈 매트릭스가 단단한 행렬에 유망한 대체 응력 지표이다는 것을 보여줍니다.
Introduction
코티솔은 동물의 스트레스를 신뢰할 수 있는 지표입니다. 코 티 솔 추출 스트레스 수준에 스트레스 수준 및 일반적인 패턴을 모니터링 하는 연구원에 대 한 유효한 프레임 워크를 제공 합니다. 예를 들어, 이전 연구는 인간1,2,원숭이3,4,가축5,양6,및 다양한 방법을 사용하여 모발 코티솔 측정의 방법론적 검증을 수행하였다. 금붕어7,8. 물고기 종에서, 비늘 등 매트릭스에서 코 티 솔 측정, 피부 점액, 대변, 그리고 혈액9 물고기 건강에 대 한 정보를 제공 하기 위해 표시 되었습니다. 혈액 샘플링이 문제가 있거나 비늘이 부족할 때, 코티솔 추출을 위한 대체 매트릭스가 필요합니다. 물고기에서, 대체 행렬은 턱뼈, 인간의 치아와 유사한 단단한 조직을 포함할 수있다(10).
생선 스트레스 수준을 결정하는 새로운 행렬 및 검증 된 기술의 개발은 외과 의사가 환경 스트레스 요인에 장기간 노출을 경험할 수있는 캐비어 산업에 특히 관심이 있습니다11. 철갑상어의 성별은 2 세 이전에 결정 될 수 없으며 외과 의사는 비늘이 없습니다. 코티솔은 성장단계2, 7,12동안 고체 행렬에 점차 적으로 축적하기 때문에 지느러미와 턱뼈와 같은 단단한 매트릭스의 장기 코티솔 축적 데이터는 스트레스에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 다른 성장 단계에서 수준. 대조적으로, 혈액 코티솔 수준은 죽음의 시간에 긴장 수준의 스냅 샷을 제공하고 정확하게 장기 양육 조건 동안 스트레스를 나타낼 수 없습니다13,14. 캐비어 시장에서 경쟁이 치열해짐에 따라 장기 사육 기간(8-12년 이상)동안 철갑상어 종중 건강한 계란 생산을 위한 스트레스 조건을 개선하기 위한 새로운 접근법이 점점 더 중요한 연구 분야입니다. 철갑상어의 높은 비용으로 인해, 수확 된 샘플은 매우 비용이 많이 듭니다 (종과 성장 단계에 따라 성숙한 물고기 당 $ 8,000-15,000), 연구 프로젝트의 제한 요소. 그러나, 철갑상어 지느러미와 턱뼈에서 코티솔 추출을 위한 적절한 기술의 개발은 양식과 소비를 위한 철갑상어 계란의 수확을 향상시키기 위하여 어류 양식 시스템 및 야생 물고기에 둘 다 유용하게 적용될 수 있었습니다 보존.
신뢰할 수있는 결과6을제공 할뿐만 아니라 적절한 코티솔 추출 기술을 선택하는 것은 시료 준비 중에 매트릭스에 존재하는 다른 화합물이 출력을 혼동하지 않도록하는 것이 매우 중요합니다. 일치하지 않는 결과. 지느러미와 턱뼈 코티솔 수치가 주변 물의 호르몬 수치에 영향을 받는지 여부를 결정하는 것이 똑같이 중요합니다. Heimbürge 외15 요인의 숫자는 나이 포함 하 여 코 티 솔 수준에 영향을 미칠 수 있습니다 제안, 성별, 임신, 시즌, 색상12,그리고 코 티 솔 추출 되는 신체 영역16. 그러나, 생선 체내에서 코티솔 추출에 대한 용매 세척의 효과에 대한 정보는 거의없으며,철갑상어 계란17을제외하고는 철갑상어에서 이러한 효과에 대해서는 전혀 알 수 없다.
철갑상어의 지느러미와 턱뼈에서 기준선 코티솔 수준을 분석하는 것은 물고기를 안락사시켜야 하지만, 이 접근법은 살아있는 외과 의사에서 혈액 샘플링에 필요한 침습적 기술을 수반하지 않습니다. 지느러미 및 턱뼈 샘플은 쉽게 수집되며 이러한 조직에서 추출하면 신속하게 수행 할 수 있습니다. 마찬가지로, 호르몬 추출 및 분석간단 하 고 거의 전문된 장비를 필요로.
이 연구에서는, 우리는 이 행렬에서 측정된 코티솔 수준이 응력으로 안정적으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것을 목표로, 물고기 지느러미및 턱뼈에서 코티솔의 추출, 세척 및 측정을 위한 새롭고 쉽게 적용된 기술을 제시합니다. 지표. 이 기술의 장점은 쉽고 비 침습적인 8 접근 법, 적은 데이터 변화 및 신뢰할 수있는 출력1,6,8,17을포함한다; 이 기술은 철갑상어와 같은 비늘이없는 물고기 종에 적용 할 수 있습니다. 이 기술은 물고기의 도살, 적절한 세척용매의 선택2,4,샘플3, 5,전문 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA)의 적절한 연삭을 필요로한다. 응용 프로그램5,7, 고체 행렬에 코티솔 소스의 통합의 광범위한 지식6.
두 개의 다른 세척 용매 (초순수 및 이소 프로판올)를 적용하여 세 가지 철갑상어 종에서 지느러미의 기저 코티솔 수준을 얻었습니다 : 벨루가(후소 후소),시베리아(Acipenser baerii),그리고 세브루가(A. stellatus) ), 각 종에 대한 표준 환경 조건하에서. H. huso의 턱뼈는 또한 외과 의사에 있는 응력 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이것은 철갑상어 턱뼈에 있는 코티솔 수준을 측정하는 첫번째 연구 결과입니다. 이 연구의 결과는 초기 성장 단계에서 철갑상어 종에 대한 비교 코티솔 데이터를 제공 할 것입니다 (~ 1 년) 섹스 결정 하기 전에.
Protocol
Representative Results
Discussion
철갑상어는 지난 천년 동안 몇 가지 적응을 전시했기 때문에 때때로 “살아있는 화석”이라고합니다. 철갑상어 속 Acipenser는 캐비어를 생산하는 27 종을 포함; 그러나, 세 종 (벨루가, baerii, 세브루가) 글로벌 캐비어 공급의 대부분을 생산하고 있습니다. 철갑상어는 자연 서식지에서 의 외낚시와 간섭에 취약하기 때문에 다른 어떤 종보다도 더 심각한 멸종 위기에 처해 있습니다. 철갑상어는 1억…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 농업과학기술개발협력연구프로그램(프로젝트제목: 기후변화에 의한 축산생산성변화분석, 프로젝트번호)의 지원으로 진행되었다. PJ012771), 한국 농촌진흥청. 또한, 이 연구는 보조금에 의해 지원되었다 (아니오. PJ01344604) 동물영양생리학과, 국립동물과학원, RDA, 서울, 대한민국. 저자는 감사페르시아 제스처 CEO 모하마드 하산 살만자데와 그의 팀을 인정, 누가이 연구에서 검사 세 철갑상어 종에서 물고기를 제공.
Materials
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. . Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. . SAS. User’s Guide (Version 8.01 Edition). , (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
