इस प्रोटोकॉल एक परिभाषित संस्कृति प्रणाली और सेल आत्म विधानसभा का उपयोग कर मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatospheres उत्पादन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल सेल लाइनों की एक संख्या में reproduible है, लागत प्रभावी और जैव चिकित्सा आवेदन के लिए स्थिर मानव hepatospheres के उत्पादन की अनुमति देता है.
जिगर के ऊतकों के अक्षय स्रोतों के विकास के लिए सेल आधारित मॉडलिंग में सुधार, और प्रत्यारोपण के लिए मानव ऊतक विकसित करने की आवश्यकता है. मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) मानव जिगर क्षेत्रों के आशाजनक स्रोतों का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से गठित तीन आयामी मानव जिगर क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए सेलुलर भेदभाव की एक सीरम मुक्त और परिभाषित विधि विकसित की है. प्रौद्योगिकी की एक संभावित सीमा के अंदर मृत सामग्री के साथ घने क्षेत्रों का उत्पादन है. इस को दरकिनार करने के लिए, हमने 3डी गोलों के आकार को नियंत्रित करने के लिए परिभाषित सेल घनत्व पर एग्रोस माइक्रोवेल प्रौद्योगिकी का उपयोग किया है, जो एपोप्टोटिक और/या नेक्रोटिक कोर की पीढ़ी को रोकता है। विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न क्षेत्रों जिगर समारोह और स्थिर phenotype प्रदर्शन, बुनियादी और लागू वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन का प्रतिनिधित्व. हमें विश्वास है कि हमारे दृष्टिकोण एक मंच प्रौद्योगिकी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है मॉडल और मानव रोग का इलाज करने के लिए और आगे के ऊतकों को विकसित करने के लिए और भविष्य में जटिल ऊतक वास्तुकला के साथ मानव ऊतक की पीढ़ी की अनुमति हो सकती है.
मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) की क्षमता स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए, जबकि pluripotency बनाए रखने, मांग पर मानव सेल प्रकार और ऊतकों का उत्पादन करने का अवसर प्रदान करता है. एचपीएससी को दो आयामी (2 डी) अनुलग्न संस्कृति प्रणालियों1,2,3,4,5,6 का उपयोग करके हेपाटोसाइट-जैसे कोशिकाओं (एचएलसी) में कुशलता पूर्वक विभेदित किया गया है। ,7,8,9,10. इन प्रणालियों को सफलतापूर्वक मोनोजेनिक रोग मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, वायरस जीवन चक्र, दवा प्रेरित जिगर की चोट (DILI), विषाक्त पदार्थों और गैर शराबी फैटी लीवर रोग के लिए भ्रूण जोखिम (NAFLD)11,12,13 ,14,15. हालांकि, इन मॉडलों के पास कुछ कमियां हैं, जो उनके नियमित उपयोग को सीमित करती हैं। उन भ्रूण मार्कर अभिव्यक्ति, अस्थिर phenotype और गरीब ऊतक वास्तुकला16,17,18,19, जो भी विवो में अंग समारोह के लिए extrapolation सीमा सकता है शामिल हैं.
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) भेदभाव प्लेटफार्मों vivo ऊतक वास्तुकला में नकल करने के लिए विकसित किया गया है. हालांकि सक्षम करने, उन दृष्टिकोण ऊतक उत्पत्ति ड्राइव करने के लिए पशु व्युत्पन्न उत्पादों और matrices के उपयोग पर भरोसा करते हैं20,21,22, सीमित पैमाने पर अप और व्यापक आवेदन.
यहाँ, हम परिभाषित सामग्री और सेल आत्म विधानसभा का उपयोग कर hPSCs से 3 डी hepatospheres की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए प्रक्रियाओं का विस्तार. विशेष रूप से, हमारी प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न ऊतक सेल संस्कृति में एक वर्ष से अधिक के लिए कार्यात्मक रहता है और विवो23में जिगर समारोह का समर्थन करने में सक्षम है।
संक्षेप में, हमारे परिभाषित भेदभाव दृष्टिकोण दोनों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से स्थिर मानव hepatospheres की पीढ़ी की अनुमति देता है. हमारा मानना है कि वर्णित प्रक्रिया बुनियादी और लागू वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए 3 डी hepatospheres की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है.
3 डी में मानव hepatospheres का उत्पादन करने के लिए परिभाषित और विदेशी मुक्त प्रणालियों के विकास दोनों इन विट्रो में और विवो प्रयासों के लिए आवश्यक है। वर्तमान में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सबसे hepatocyte भेदभाव दृष्टिकोण दो आयामी अनुयायियों संस्कृतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं. इन वातावरण ऊतक उत्पत्ति और homeostasis जो शामिल में शामिल पर्यावरण संकेतों के कई कमी; विषमप्ररूपी कोशिका अन्योन्यक्रिया, मैट्रिक्स उत्पादन और पुन: तैयार करना,जिसके परिणामस्वरूप विवो जीव विज्ञान 18,19में खराब अनुवाद होता है।
एक परिणाम के रूप में, अनुसंधान वैकल्पिक दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित किया है pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatospheres उत्पन्न करने के लिए. 3 डी अध्ययन के एक नंबर क्षेत्र उन्नत है, लेकिन उन पशु उत्पादों पर निर्भर कर रहे हैं 20,22,24 सहायता प्रदान करने के लिए और / प्रौद्योगिकी पैमाने पर अप और समझौता प्रयोगात्मक reproducibility और आवेदन.
हमारे लेख में वर्णित प्रक्रिया (चित्र 1) परिभाषित किया गया है, कुशल, अत्यधिक reproditible और लागत प्रभावी, कार्यात्मक जिगर क्षेत्रों के उत्पादन की अनुमति है, जो इन विट्रो में एक वर्ष से अधिक कार्यात्मक रहते हैं और में महत्वपूर्ण जिगर का समर्थन प्रदान विवो14| महत्वपूर्ण बात, इस मंच उपयोगकर्ता 3 डी जिगर क्षेत्रों के आकार को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है, घने नेक्रोटिक केन्द्रों के गठन और phenotype के नुकसान को सीमित.
पाली हेमा लेपित प्लेटों के लिए 3 डी hepatospheres के हस्तांतरण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. क्षेत्र को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए प्रक्रिया में इस स्तर पर धीरे से पिपेट करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मीडिया परिवर्तन ध्यान से कतरनी तनाव और क्षेत्र संरचना के विरूपण से बचने के लिए किया जाना चाहिए.
इन अध्ययनों में, 3D hepatospheres एक संगठित संरचना प्रदर्शित (चित्र 2 और चित्र 3), साइटोक्रोम P450 समारोह ( चित्र4) और स्रावित जिगर प्रोटीन, एल्बुमिन और अल्फा-फेटोप्रोटीन सहित (चित्र 5) . इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक तुलनीय परिणामों के साथ चार pluripotent स्टेम सेल लाइनों में किया गया है. आगे देखते हुए, इस तकनीक को जटिल आर्किटेक्चर के साथ आगे एंडोडर्मल और मेसेन्काइमल ऊतकों को विकसित करने के लिए एक मंच के रूप में नियोजित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को यूके पुनर्योजी चिकित्सा प्लेटफार्म (एमआरसी एमआर/L022974/1) और मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसीएस/16/37) से पुरस्कारों के साथ समर्थित किया गया था।
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |