Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het manipuleren van genen in hematopoietische stamcellen met conventionele Transgenese benaderingen kan tijdrovend, duur en uitdagend zijn. Met het voordeel van de vooruitgang in de genoom Editing technologie en lentivirusgemedieerde transgen toedieningssystemen, wordt hier een efficiënte en economische methode beschreven die muizen vastlegt waarin genen specifiek worden gemanipuleerd in hematopoietische stamcellen. Lentivirussen worden gebruikt om Cas9-uitverkorende Lineage-negatieve beenmergcellen te leiden met een RNA-gelei (gRNA) gericht op specifieke genen en een rood fluorescentie reporter-gen (RFP), waarna deze cellen worden getransplanteerd in dodelijk bestraalde C57BL/6 muizen. Muizen die worden getransplanteerd met lentivirus die niet-gerichte gRNA uitdrukken, worden gebruikt als besturingselementen. Engraftment van getransduceerde hematopoietische stamcellen wordt geëvalueerd door flowcytometrische analyse van RFP-positieve leukocyten van perifeer bloed. Met behulp van deze methode, ~ 90% transductie van myeloïde cellen en ~ 70% van lymfoïde cellen na 4 weken na transplantatie kan worden bereikt. Genomisch DNA is geïsoleerd van RFP-positieve bloedcellen, en delen van het doelwit van het DNA van de site worden versterkt door PCR om de genoom bewerking te valideren. Dit protocol biedt een evaluatie van de hoge doorvoer van Hematopoiesis-regelgevende genen en kan worden uitgebreid naar een verscheidenheid van muis ziekte modellen met hematopoietische celbetrokkenheid.
Inleiding
Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen 1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dierproef personen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Virginia.
1. opwekking en zuivering van lentivirusdeeltjes
Opmerking: Lentivirusdeeltjes met de geoptimaliseerde handleiding RNA kunnen worden geproduceerd door de gedetailleerde protocollen die door Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. De geoptimaliseerde methoden voor de bereiding en opslag van hoogtiter lentivirus worden elders besproken17,18. ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het hierboven beschreven protocol zijn ongeveer 0,8-1,0 x 108 beenmergcellen per muis verkregen. Het aantal Lineage-negatieve cellen die we verkrijgen is ongeveer 3 x 106 cellen per muis. Typisch, de opbrengst van beenmerg Lineage-negatieve cellen is 4%-5% van die van totale beenmerg kern cellen.
Het chimerisme van getransduceerde cellen (RFP-positief) wordt geëvalueerd door Flowcytometrie va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het voordeel van dit protocol is de creatie van diermodellen die specifieke mutaties in hematopoietische cellen in een snelle en zeer kosteneffectieve manier verteren in vergelijking met conventionele muis transgene benaderingen. Bleek dat deze methodologie maakt het genereren van muizen met hematopoietische cel gen-manipulaties binnen 1 maand. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die verder moeten worden overwogen.
Screening van de gRNA-sequentie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
S. S. werd gesteund door een Amerikaanse hart vereniging Postdoctoral Fellowship 17POST33670076. K. W. werd ondersteund door NIH subsidies R01 HL138014, R01 HL141256, en R01 HL139819.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | algemeen benodigd |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216-- | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antilichamen |
| APC-Cy7-anti-muis CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antilichamen |
| BD Luer-Lok wegwerpspuiten, 10 ml | BD | 309604 | algemeen benodigd |
| BD Microtainer bloedafnamebuisjes, K2EDTA toegevoegd | BD Bioscience | 365974 | algemeen benodigd |
| BD Precisionglide naald, 18 G | BD | 305195 | algemeen benodigd |
| BD Precisionglide naald, 22 G | BD | 305155 | algemeen benodigd |
| BV510-anti-muis CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antilichamen |
| BV711-anti-muis CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antilichamen |
| Kalfshuidcollen | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | algemeen benodigd |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | algemeen benodigd |
| CRISPR/Cas9 knock-in muizen | The Jackson Laboratory | 028555 | muis |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | algemeen benodigd |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - hoge glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Oplossing |
| Falcon 100 mm TC-behandelde celkweker | Life Sciences | 353003 | algemeen benodigd |
| Falcon 5 mL ronde bodem polystyreen testbuis | Life Sciences | 352054 | algemeen benodigd |
| Falcon 50 mL Kegelcentrifugebuizen | Fisher Scientific | 352098 | algemeen benodigd |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bodem TC-behandelde Multiwell Celkweker Plate | Life Science | 353046 | algemeen benodigd |
| Fisherbrand microhematocrit capillaire buisjes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | algemeen benodigd |
| Fisherbrand steriele celstrainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | algemeen benodigd |
| FITC-anti-muis CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antilichamen |
| Fixatie Buffer | BD Bioscience | 554655 | Oplossing |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) oplossing | Henry Schein | 29404 | Oplossing |
| Lenti-X qRT-PCR Titratie Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, muis | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Spuitfilter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | algemeen benodigd |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Oplossing |
| PE-Cy7-anti-muis CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antilichamen |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Oplossing |
| Penicillin-Streptomycin Mixtuur | Lonza | 17-602F | Oplossing |
| PerCP-Cy5.5-anti-muis Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antilichamen |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infectie/Transfectiereagens | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Oplossing |
| Polypropyleen Centrifugebuizen | BECKMAN COULTER | 326823 | algemeen benodigd |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Muis Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | algemeen benodigd |
| Recombinant Muur SCF | Peprotech | 250-03 | Oplossing |
| Recombinant Muur TPO | Peprotech | 315-14 | Oplossing |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Oplossing |
| TOPO TA cloning kit voor sequencing met One Shot TOP10 Chemisch Competente E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Oplossing |
Referenties
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed thro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
