Ein Antikörper-Fütterungsansatz zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels in dissoziierten primären Hippocampuskulturen

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt eine Methode zur Untersuchung des Schleimatrezeptorhandels (GluR) in dissoziierten primären Hippocampuskulturen vor. Mit einem Antikörper-Fütterungsansatz zur Kennzeichnung endogenes oder überexprimierter Rezeptoren in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen ermöglicht diese Methode die Identifizierung molekularer Mechanismen zur Regulierung der GluR-Oberflächenexpression durch Modulation Internalisierungs- oder Recyclingprozesse.

Zusammenfassung

Zelluläre Reaktionen auf äußere Reize hängen stark von der Reihe von Rezeptoren ab, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an der Zelloberfläche ausgedrückt werden. Dementsprechend passt sich die Population der oberflächenausgedrückten Rezeptoren ständig an und unterliegt strengen Regulationsmechanismen. Das paradigmatische Beispiel und eines der am meisten untersuchten Handelsereignisse in der Biologie ist die regulierte Kontrolle der synaptischen Expression von Glutamatrezeptoren (GluRs). GluRs vermitteln die überwiegende Mehrheit der exzitatorischen Neurotransmission im zentralen Nervensystem und steuern physiologische aktivitätsabhängige funktionelle und strukturelle Veränderungen auf synaptischer und neuronaler Ebene (z. B. synaptische Plastizität). Veränderungen in der Anzahl, Lage und UntereinheitZusammensetzung der Oberfläche ausgedrückt GluRs tief beeinflussen neuronale Funktion und in der Tat, Veränderungen in diesen Faktoren sind mit verschiedenen Neuropathien verbunden. Präsentiert hier ist eine Methode zur Untersuchung des GluR-Handels mit dissoziierten Hippocampus-Primärneuronen. Ein "Antikörper-Feeding"-Ansatz wird verwendet, um GluR-Populationen, die an der Oberfläche und den inneren Membranen ausgedrückt werden, differenziell zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung von Oberflächenrezeptoren auf lebenden Zellen und deren Fixierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten, um Rezeptoren-Endozytose und/oder Recycling zu ermöglichen, können diese Handelsprozesse evaluiert und selektiv untersucht werden. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, das in Kombination mit pharmakologischen Ansätzen oder Überexpression veränderter Rezeptoren verwendet werden kann, um wertvolle Informationen über Reize und molekulare Mechanismen zu gewinnen, die den GluR-Handel beeinflussen. In ähnlicher Weise kann es leicht angepasst werden, um andere Rezeptoren oder oberflächenausgedrückte Proteine zu untersuchen.

Einleitung

Zellen nutzen den aktiven Prozess des Menschenhandels, um Proteine zu bestimmten subzellulären Lokalisationen zu mobilisieren und eine strenge raumzeitliche Regulierung über ihre Funktion auszuüben¹. Dieser Prozess ist besonders wichtig für Transmembran-Rezeptoren, da zelluläre Reaktionen auf verschiedene Umweltreize auf intrazellulären Kaskaden beruhen, die durch Dieoraktivierung ausgelöst werden. Zellen sind in der Lage, diese Reaktionen zu ändern, indem sie die Dichte, Lokalisierung und Zusammensetzung der Untereinheiten von Rezeptoren ändern, die an der Zelloberfläche über die subzelluläre Handelsverordnung^desRezepto....

Protokoll

Die Arbeiten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Primärkultur im Hippocampus wurden vom Northwestern University Animal Care and Use Committee (Protokoll #IS00001151) überprüft und genehmigt.

1. Vorbereitung vor der Etikettierung

1. Vorbereitung und Aufrechterhaltung der primären Hippocampuskulturen
   1. Bereiten Sie primäre Hippocampuskulturen mit einer Dichte von 150.000 Zellen vor, die auf poly-D-Lysin-beschichteten (0,1 mg/ml) 18 mm Deckgläsern plattiert sind. Ausgezeichnete Anleitungen für dissoziierte neuronale Kulturvorbereitung sind verfügbar^7,8

Ergebnisse

Dieses Protokoll zur Untersuchung des Schmieramrezeptorhandels basiert auf der Differentialkennzeichnung von Rezeptoren, die an der Zelloberfläche ausgedrückt werden, und solchen, die in internen Membranen ausgedrückt werden. Die Segregation wird durch die Kennzeichnung der Rezeptoren vor und nach der Membranpermeabilisierung unter Verwendung desselben primären Antikörpers, aber eines sekundären Antikörpers, der mit einem anderen Fluorophor konjugiert ist, erreicht. Wie in den optionalen .......

Diskussion

Die Interaktion zwischen einer Zelle und ihrer Umgebung (z. B. Kommunikation mit anderen Zellen, Reaktion auf unterschiedliche Reize usw.) beruht stark auf der korrekten Expression von Rezeptoren an der Zelloberfläche. Die schnelle und fein abgestimmte Regulierung des oberflächenausgedrückten Rezeptorinhalts ermöglicht eine angemessene zelluläre Reaktion auf eine sich ständig verändernde Umgebung. Im besonderen Fall von Neuronen, Veränderungen in der Anzahl, Lokalisierung und Untereinheit Zusammensetzung der synaptisch e.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
18 mm Ø #1,5 dicke Deckgläser	Neuvitro	GG181.5
Alexa 555-konjugierte Ziegen gegen Maus	sekundär Life Technologies	A21424
Alexa 555-konjugierte Ziegen gegen Kaninchen sekundär	Life Technologies	A21429
Alexa 647-konjugierte Ziegen gegen Maus	sekundär Life Technologies	A21236
Alexa 647-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärwaffe	Life Technologies	A21245
B27	Gibco	17504044
CaCl2	Sigma	C7902
Corning Costar Zellkulturplatten mit flachem Boden	Corning	3513
Dynasore	Tocris	2897
Glukose	Sigma	G8270
Glycin	Tocris	0219
Ziege Anti-Kaninchen Fab Fragmente	Sigma	SAB3700970
HEPES	Sigma	H7006
KCl	Sigma	P9541
L-Glutamin	Sigma	G7513
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Maus Anti-GluA1-Antikörper	Millipore	MAB2263
NaCl	Sigma	S6546
Neurobasal Media	Gibco	21103049
NGS	Abcam	Ab7481
Parafilm	Bemis	PM999
PBS	Gibco	10010023
Pelco BioWave	Ted Pella	36500
PFA	Alfa Aesar	43368
Picrotoxin	Tocris	1128
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma	P7280
ProLong Gold Antifade Mountant	Life Technologies	P36934
Kaninchen Anti-GFP-Antikörper	Invitrogen	A11122
Kaninchen Anti-PSD-95 Antikörper	Zellsignalisierung	2507
Strychnin	Tocris	2785
Saccharose	Sigma	S0389
Superfrost plus Objektträger	Fisher	12-550-15
Triton X-100	Sigma	X100
TTX	Tocris	1078