在这里,我们提出了易于使用的协议,通过大肠杆菌或尼科蒂亚纳本塔米亚中的生物合成酶的组合表达来生产和纯化二苯基代谢物,然后是色谱产物净化。由此产生的代谢物适用于各种研究,包括分子结构表征、酶功能研究和生物活性测定。
二苯醚类形成一类多样化的小分子天然产物,广泛分布于生命王国,在发育过程、组织间相互作用和环境适应中具有重要的生物功能。由于这些不同的生物活性,许多二甲苯类药物也具有经济重要性,如药品、食品添加剂、生物燃料和其他生物产品。先进的基因组学和生化方法使对二苯基代谢基因、酶和通路的知识迅速增加。然而,二苯甲苯的结构性复杂性和单个化合物在单个物种中狭窄的分类分布,仍然是限制其有效生产的因素。更广泛的代谢酶现在为生产足够的二苯并物质和纯度提供了资源,以促进对这一重要代谢物群的深入研究。利用微生物和植物酶共表达的既定工具,我们提出了一个易于操作和可定制的方案,用于在大肠杆菌或尼科蒂亚纳本查米亚纳的酶化生产二苯基苯甲酮,通过硅色谱和半预准备HPLC对所需产品的纯化。以玉米组 (Zea Mays) 多拉布拉辛二苯基异物为例, 我们强调如何使用二苯甲苯合成酶 (diTPS) 和细胞色素 P450 单氧酶 (P450) 酶的模块化组合来生成不同的二苯甲苯脚手架。纯化化合物可用于各种下游应用,如代谢物结构分析、酶结构功能研究以及体外和植物生物活性实验。
二苯酚由12,000多种以多环20碳天然产品组成的化学多样性组组成,在许多生物体中起着关键作用。真菌和植物产生最大的多样性的二甲苯类化合物,但细菌也已被证明形成生物活性二苯甲苯类化合物(见评论2,3,4,5)。植根于其巨大的结构多样性, 二苯甲醚服务于多种生物功能.少数二苯甲苯,如赤霉素生长激素,在发育过程中具有基本功能5。然而,大多数二苯甲苯类化合物是化学防御和组织间相互作用的中介。其中,针叶树的害虫和病原体防御中的二苯基树脂酸,以及玉米(Zea Mays)和水稻(Oryzasativa)等主要粮食作物中抗菌二苯酚的物种特异性混合物中,其范围最为广泛。研究6,7。这些生物活性为商业应用提供了丰富的化学储存库,而精选的二苯甲酮被用作现代生活中重要的药品、食品添加剂、粘合剂和其他生物产品8、 , 10.为了推进对二苯醚的自然多样性和生物功能的研究,并最终促进更广泛的商业应用,需要为具有成本效益的纯化合物制备工具。已经为一些二烯类生物制品建立了与植物材料的大规模隔离,例如作为纸浆和造纸工业的副产品生产的二苯基树脂酸。然而,仅在特定组织中积累二苯基苯甲苯,并在环境刺激的严格监管下,往往限制了从天然生产者2分离足够的产品量。此外,二苯甲苯的结构复杂性阻碍了其通过化学合成的生产,尽管这些方法在一些情况下已经成功11,12。随着先进的基因组和生化技术的可用性,酶生产平台在生产一系列二苯甲酮化合物方面越来越受到关注(见评论13,14,15,16,17,18。
所有三烯类化合物,包括二苯甲酸酯,均来自两个异位异类前体,二磷基苯甲基(IPP)和二甲基二磷酸二磷酸二醇(DMAPP)19,反过来,通过甲氧酸酯(MVA)或甲基二甲二醇-5-磷酸盐(MEP)途径。特氏体生物合成通过细菌中的MEP通路和真菌中的MVA通路进行,而植物则具有细胞体MVA和表皮MEP通路,后者是二苯甲苯形成的主要途径20。IPP和DMAPP的冷凝通过前尼转移酶产生中央20碳前体的所有二苯基苯甲酸二醇,二磷酸盐(GGPP)20。在GGPP形成的下游,两个酶系,三烯合成酶(TTPS)和细胞色素P450单氧酶(P450s)在很大程度上控制了三烯代谢的庞大化学多样性21、22的形成。二聚苯乙烯合成酶 (diTPS) 催化承诺的雕刻驱动循环和重新排列的 GGPP 形成各种立体特异性双、多、或宏观环二苯基器支架1,3,23 , 24.然后由P450酶和选择其他酶族22、25促进这些支架的氧化和进一步功能装饰。TTPS 和 P450 通常作为物种特定的多基因家族存在,可以形成模块化生物合成网络,结合共同蓝图的不同酶模块,从而形成广泛的化合物2。26.近年来,在模块化三烯体通路中运行的功能独特的酶的迅速发现,为它们作为部分或完整通路的代谢工程的多功能部件列表提供了不断扩大的机会。微生物和植物生产平台。例如,酵母(糖母素)已成功应用于设计用于制造三烯类生物制品的多酶通路,如抗疟药物青蒿素27、Sesquiterpenoid生物燃料比萨博列和法尔内内28,但也选择了二苯甲苯29,30,31。同样,为工业规模制造而设计的大肠杆菌平台已经为一些二苯丙酮代谢物而建立,包括用作抗癌药物的Taxol前体Taxadiene和二苯酚醇,sclareol,用于香水行业13,32,33,34.基因工程和转化技术的进步也使植物宿主系统越来越适用于生产植物天然产物9,14,35,36。特别是,密切的烟草亲戚,尼科蒂亚娜本查米亚纳,已成为一个广泛使用的底盘的三苯酮通路分析和工程,由于容易的农业细菌介导转换的多个基因组合,内源前体的有效生物合成,高生物量14,35,36。
利用这些已建立的三烯生物合成平台,我们在这里描述了用于酶化生产二苯酮和纯化单一化合物的易于使用且经济高效的方法。所提出的协议说明了如何利用大肠杆菌和N.benthamiana平台,用于增强二烯体前体生物合成,以组合表达不同的二苯基苯甲醚和P450酶,以产生所需的二苯二烯化合物。该协议在生产和纯化结构上不同的二苯基苯甲苯(二苯类)的实例中显示了来自玉米(Zea Mays)的专用二苯甲苯(Zea Mays),称为多拉布拉列辛,其内源性生物合成,其中招募了两个二TPS和一个P450酶。通过将分离漏斗萃取与大规模硅柱色谱和预置高压液相色谱(HPLC)相结合,实现从烯烃到含氧衍生物的不同多拉拉列辛的纯化。所述协议针对二苯甲苯类的产生进行了优化,但也可轻松适应相关的类,以及可用于酶资源的其他天然产品。使用这种方法生产的化合物适用于各种下游应用,包括但不限于通过核磁共振 (NMR) 分析进行的结构表征、用作酶功能研究的基质,以及一系列生物活性测定。
更广泛的调查和应用二苯甲苯天然产品需要简单,廉价的协议来合成和纯化足够数量的所需化合物。各种物种中可用的二苯基代谢酶数量迅速增加,这为使用微生物和植物宿主系统的二苯甲苯类酶的酶生产提供了广阔的库存。此外,许多二苯醚通路的模块化架构允许在”即插即用”组合工程方法中使用来自相同或不同物种的酶,以生成一系列天然和新的自然类二苯类天然产品2,14,26,35.
大肠杆菌是天然产品生物合成的首选微生物宿主,因其坚固性、易伸缩性、减少副产品污染的化学复杂性有限以及可用于 DNA 组装和表达的丰富工具优化。根据我们的经验,这里描述的平台非常适合生产高达几百毫克的二烯烯烃和醇的产品产量,适用于许多下游应用,包括这里提出的应用。虽然不符合工业规模,但此处所述的生产平台可以作为进一步途径、宿主和发酵优化的基础,正如已成功地证明相关的二苯酚(如 taxadiene 和 sclareol33)一样 , 34.已成功地建立了速率限制 MVA 或 MEP 通路基因的表达,以克服二苯基苯甲酸盐生物合成的产量限制因素,例如前体供应不足和前体通量进入竞争途径13 32,33,39.虽然在多项研究中证明是成功的,但大肠杆菌中三烯代谢真核P450s和其他膜结合酶的表达和催化活性差是一个可能的限制因子33,39 ,48,49,50,51,52。使用科顿优化的序列和蛋白质修饰,如去除内质视网膜信号肽或引入一个板面信号肽,已被证明有助于增加可溶性P450表达14,38 ,49,50,53.这种修饰也用于玉米CYP71Z1839的微生物共表达,作为本研究的范例途径。所述协议基于每个构造携带一个或两个基因的质粒的使用,所有基因都位于同一诱导启动子之下。在需要大规模基因组合的情况下,建议使用各种可用的多基因盒或基因堆叠系统,以减轻由于使用多种质粒和抗生素而降低转化效率和培养增长的情况 13.
随着遗传学和基因组学资源的广泛普及,植物宿主系统也越来越适合制造天然产品。优点包括植物能够生产所需的天然前体由光合作用,从而使产品形成,而无需补充前体分子54,55。N. 本查米亚纳已广泛用于体内功能表征和组合表达的三苯酮和其他天然产物通路14,35,36,40.使用N. benthamiana作为宿主系统的显著优势包括二苯甲苯前体的内源性生产、使用本地基因序列、简化真核P450s的表达、易于组合基因转化(如瞬态共转化不需要单独的抗生素,并且从叶材料中简单提取目标产品。必要时,可通过共同表达关键MEP通路基因来增强二苯基苯甲苯的产生,以增加前体供应36,41。与液体微生物培养相比,在N.benthamiana中可扩展的二苯并苯生产的限制更为复杂,因为需要产生足够的植物生物量,从化学复杂物中更劳动密集型的产品进行纯化植物组织,以及目标产品的可能不需要的代谢,例如,氧化、糖基化或内源酶的脱磷酶36、43、44、45 ,46,47.然而,通过增加用于农业渗透的植物数量,可以扩大到毫克产品数量56。
此处描述的产品提取和纯化方案与大肠杆菌和N.benthamiana,以及S.cerevisiae和其他植物或微生物宿主系统兼容,并提供一种经济高效的方法,易于在生物和化学实验室建立,不需要昂贵的净化设备。使用分色漏斗提取代谢物非常适合在色谱纯化之前进行高效提取和相分离。漏斗尺寸可以很容易地调整,以允许更大的培养量,并减少从大型培养物中提取所需的实验时间。我们发现,使用己氧/乙酸乙酯梯度是提取不同极性二苯基的理想产物,这里就证明了包括碳氢化合物和含氧化合物的多拉布拉辛组(图3)。根据目标产品的性能,其他溶剂混合物可能具有优势。但是,溶剂不得与水相融合,以确保使用分离漏斗技术成功提取和相分离。此外,在使用这种方法生产挥发性有机化合物(VOC)时,必须考虑蒸发产生的产品损失,例如低分子量单体和分体类化合物以及其他挥发性有机化合物。使用较大规模(±2 L)二氧化硅柱对不同氧化水平的二甲苯的色谱分离对我们的经验有利,因为它提供了改进的产品分离,并最大限度地减少了迭代纯化的需要使用较小的列卷时的步骤。可以根据需要根据所需的培养量和天然产品类型调整列卷和矩阵。使用该协议可实现的目标产品的纯度适用于许多下游应用,如生物活性测定或酶活性分析。然而,当需要更高的纯度时,例如通过NMR进行结构分析,通过使用(半)预置HPLC进行额外的纯化可以有效地提高产品纯度。
此处描述的此协议已针对二苯甲苯基天然产物的生产进行了优化,但也可以轻松定制到相关的单体、分体和三元苯甲酯,以及其他天然产品类别,只需生成所需的酶组合表达式14,57的模块。但是,对于挥度较高的化合物,如单体和分体,或更高的极性和功能修饰,必须考虑产品提取和纯化程序的修改,许多三烯酰胺、苯丙酮和其他天然产物的糖基化。
尽管有工业规模的天然产品制造平台,但此处描述的协议提供了一种价格低廉、可定制的工具,可在大多数实验室轻松设置。正如在这里和其他地方生产玉米多拉布拉辛所所证明的39,使用这种方法可以达到的产品数量和纯度通常足以促进各种下游分析和使用,包括,但不限于各种生物活性研究,分析生物体之间的相互作用,以及用作酶基质或半合成方法的起始材料。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢鲁本·彼得斯博士(美国伊奥瓦州立大学)提供pIRS和pGGxZmAN2结构。NSF 植物-生物相互作用计划(授予 1758976 到 P.Z.)、DOE 早期职业研究计划(授予# DE-SC0019178 到 P.Z.)、DOE 联合基因组研究所社区科学计划(授予 CSP2568 到 P.Z.))为这项工作提供财政支持研究生研究奖学金计划(到K.M.M.),和加州大学戴维斯分校院长导师奖奖学金(K.M.M.)是感谢感谢。
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
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Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |