Præsenteret her er en protokol til at bruge CRISPR-Cas9 system til at reducere produktionen af et protein i den voksne honningbi hjerne til at teste antistof specificitet.
Cluster Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) er et genredigeringsteknik, der i vid udstrækning anvendes i undersøgelser af genfunktion. Vi bruger denne metode i denne undersøgelse til at kontrollere for specificiteten af antistoffer udviklet mod insektet GABAA receptor subunit Resistens over for Dieldrin (RDL) og en metabotropic glutamat receptor mGlutR1 (mGluRA). Antistofferne blev genereret i kaniner mod de konjugerede peptider, der er specifikke for bananfluer (Drosophila melanogaster) samt honningbier (Apis mellifera). Vi brugte disse antistoffer i honningbi hjerne sektioner til at studere fordelingen af receptorer i honningbi hjerner. Antistofferne blev affinitet renset mod peptidet og testet med immunblotting og den klassiske metode til preadsorption med peptid konjugater for at vise, at antistofferne er specifikke for de tilsvarende peptid konjugater, som de blev rejst. Her udviklede vi CRISPR-Cas9-teknikken til test for reduktion af proteinmål i hjernen 48 timer efter CRISPR-Cas9 injektion med guide-RNA’er designet til den tilsvarende receptor. CRISPR-Cas9-metoden kan også bruges i adfærdsanalyser hos de voksne bier, når et eller flere gener skal ændres.
Det nyligt opdagede CRISPR/Cas9-system er et kraftfuldt værktøj, der er blevet brugt til at ændre genomisk DNA i forskellige modelsystemer og organismer. Det har fremskyndet biomedicinsk forskning og store teknologiske gennembrud ved at gøre genommodifikation mere effektiv og robust end tidligere metoder1. Hjemmehørende i S. pyogenes bakterier, systemet er afhængig af en Cas9 endonuclease, hvis aktivitet fører til dobbelt-strandede pauser (DSBs) i DNA, og en guide RNA (gRNA), der dirigerer Cas9 protein til en bestemt, sekvens-afhængige placering2. Dobbeltstrengede pauser genereret af CRISPR/Cas9 kan repareres via ikke-homolog sluttilslutning (NHEJ), en fejlbehæftet proces, der kan føre til frameshifts, eller homologi direkte reparation, når en donorskabelon er til stede. GRNA består selv af et målspecifikt CRISPR RNA (crRNA) og et universelt transaktiverende crRNA (tracrRNA), som kan syntetiseres kemisk og leveres med renset Cas9 nuklease som ribonucleoproteinkompleks (RNP)2,3. Fluorescerende mærkning af gRNA eller Cas9 nuclease kan give mulighed for påvisning og intracellulær visualisering af molekylære komponenter via fluorescerende mikroskopi4.
I vores nuværende arbejde udnytter vi CRISPR-Cas9-systemet til at reducere proteinniveauet i voksne honningbihjerner. Vi undersøgte den metabotropic glutamatreceptor (mGluR) og anti-mGlutR1 receptorantistoffer og GABA A-receptorens underenhed RDL og anti-RDL antistoffer. Vi udviklede en enkel metode til at reducere mængden af protein i hjernen hos den voksne honningbi og brugte det til at drive yderligere test af de antistoffer, der er udviklet mod de tilsvarende proteiner. Overvågning af CRISPR-Cas9’s fluorescens gjorde det muligt for os at anslå de områder og celler, der er involveret i reduktionen af proteinet.
Ved hjælp af denne metode karakteriserede vi også de anti-mGlutR1 antistoffer, der blev fremstillet i kaniner mod det konjugerede peptid. Honningbigenomet koder en meget bevaret AmGluRA (navngivet mGlutR1 i henhold til NCBI-nomenklaturen) metabotropic glutamatreceptor5. Honningbi mGlutR1-genet har fire forudsagte splejsningsvarianter i henhold til NCBI-databasen. Det er blevet rapporteret, at det er udtrykt i centralnervesystemet (CNS) af både pupal og voksen bi stadier, og det er involveret i langsigtet hukommelse dannelse5. Antistoffer udviklet mod mGlutR1 kan være et vigtigt redskab til at studere det glutamatergic system i læring og hukommelse proces i honningbier.
I vores undersøgelser karakteriserede vi også anti-RDL antistoffer udviklet i kaniner, der er immuniseret med konjugerede peptider fra Apis mellifera RDL-receptorens underenhed. Honeybee Rdl-genet, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI-databasen), har 14 forudsagte splejsningsvarianter. Der er rapporteret et delvist klonet fragment i NCBI-databasen AF094822.1. RDL receptor funktion og dens fysiologi er godt undersøgt hos insekter6,7,8, herunder honningbier9,10,11. Antistoffer udviklet mod anti-RDL kan være et vigtigt redskab til at studere GABAergic systemet i læring og hukommelse proces i honningbier.
En tidligere undersøgelse af den rolle, som octopamin- og tyratinreceptorer anvendte RNAi sprøjtes ind i hjernen med en efterfølgende test af mængden af protein ved Western blot12,13. RNAi har dog nogle betydelige begrænsninger. Der er kun et kort tidsrum efter RNAi injektion, inden for hvilket en reduktion af protein opstår13. CRISPR-Cas9 blev for ganske nylig anvendt i honningbiembryoner til at slette eller ændre gener hos hele dyret14,15,16. Vi rapporterede brugen af CRISPR-Cas9 til at reducere mængden af protein i den voksne honningbi. Vi udviklede denne tilgang til honningbier på grund af evnen til at koble den til adfærdsmæssige undersøgelser af læring og hukommelse under kontrollerede laboratorieforhold17.
I dette arbejde udviklede vi antistoffer mod to receptorer og testede dem på de voksne honningbihjernesektioner, efter at proteinet blev reduceret med CRISPR-Cas9 injektion. Samtidig etablerede vi et eksperimentelt design, der tillader brug af metoden til adfærdsmæssige eksperimenter.
Karakterisering af anti-RDL og anti-mGlutR1
Først karakteriserede vi anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer ved immunblot og pre-adsorption på skiver af faste honningbi hjerner. Hvert antistof blev lavet til at genkende alle sine kendte isoformer, og vestlige analyse viser, at de genkender bands, der svarer til deres forudsagte molekylvægte. Dernæst blev begge antistoffer blokeret af det konjugerede peptid, som de blev produceret på honningbihjernesektioner.
Et af de første mål i vores undersøgelse var at fastslå, at de antistoffer, der produceres mod det specifikke konjugerede peptid, er specifikke for dets protein i fast hjernevæv. Til dette formål benyttede vi os af CRISPR-Cas9-systemet. Vi designede specifikke vejledninger til honningbi RDL og mGlutR1 og brugte hver af dem til at gøre CRISPR-Cas9 mærket med fluorescerende sonden ATTO550. For hver receptor injicerede vi en blanding af tre forskellige CRISPR-Cas9 ribonukleoproteiner i ocellien for at reducere mængden af det målrettede protein i den voksne honningbihjerne ved at eliminere det tilsvarende gen i celler, der tog vores designede Cas9-system. I vores undersøgelse, opnåede vi dette skridt.
Et af de første afgørende skridt for succes af disse eksperimenter er at designe den relevante guide RNA’er. Vi anbefaler at designe op til fem guide DEA’er, der er placeret i begyndelsen, midten og slutningen af gensekvensen. I vores indledende arbejde testede vi dem i forskellige kombinationer på tre til fem bier. Vi har også prøvet forskellige koncentrationer af injektioner, samt tidspunkter efter injektion, og forskellige blandinger af RNP i injektioner. Vi dissekeret ud hjerner og forarbejdede dem ved hjælp af anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer. I disse indledende tests etablerede vi den rette kombination, postinjektionstid samt koncentrationen og mængden af CRISPR-Cas9 til injektion. Disse indledende test var grundlaget for at oprette de eksperimenter, som vi beskrev i detaljer her.
Målet var dobbelt: 1) at demonstrere i en bi, at vores antistof farvning blev reduceret efter behandling med CRISPR-Cas9 og 2) til at arbejde gennem de bedste eksperimentelle betingelser for adfærdsmæssige undersøgelser. Således viser vi, at hvis mange celle kerner indeholder CRISPR-Cas9 48 h efter injektion, reduktion af anti-RDL og anti-mGlutR1 farvning er betydelig. Derudover, der viser, at de testede antistoffer specifikt genkende mGlut1 og RDL protein i honningbi hjerne forberedelse, og at de kan bruges til lokalisering undersøgelser i honningbi hjernen.
Eksperimentel indstilling CRISPR-Cas9 til adfærdsundersøgelse
Dernæst har vi oprettet eksperimenter, så CRISPR-Cas9 kunne bruges i adfærdsmæssige undersøgelser. Otte eller ni honningbier blev indsamlet til kontrol og eksperimentelle behandlinger. De blev rutinemæssigt testet før og efter injektion, og derefter deres hjerner blev behandlet for ATTO550 og / eller immuncytokemi til at bestemme hjernen regioner, der viste reduktion af målet protein. Her er det vigtigt at bemærke, at antallet af bier, der blev taget for et sæt forsøg, ikke var begrænset til mere end 8-9 bier til kontrol- og forsøgsbetingelserne. På denne måde kan begge betingelser testes samme dag. Også, når vi forberedt CRISPR-Cas9 blandinger til injektion, vi aldrig frøs dem. CRISPR-Cas9-blandingen ændrede sig ikke i styrke, når den blev brugt 3 dage i træk og holdt ved 4-8 °C. Men vi har ikke teste det efter 3 dage.
Som vi beskrev i afsnittet Resultater for begge sæt eksperimentelle injektioner og for begge antistoffer, viste kun tre bier fra 16 testede en stor fordeling ATTO550 i champignonkroppen, protocerebrum og antennelapper. I alle andre bier var fordelingen af CRISPR-Cas9 begrænset til svampekroppen, det centrale kompleks og/eller det bageste protocerebrum. Det er vigtigt at forstå for enhver adfærdsmæssige undersøgelser, at ved hjælp af denne injektion metode reduktion af mål protein vil være begrænset kun til champignon kroppen i de fleste af bierne. Det vil ikke udvide til antennal lap eller subesofageal ganglion. Således injektion teknik, som vi bruger, er egnet til at undersøge effekten af reduktionen af receptorer i champignon kroppen og centrale kompleks i adfærdsmæssige eksperimenter, mens en anden metode til at indføre CRISPR-Cas9 vil være mere hensigtsmæssigt for at studere andre hjerneregioner.
Afslutningsvis viste vores undersøgelse en vellykket anvendelse af CRISPR-Cas9 som en kontrol for antistoffarvning i hjernen. For begge antistoffer (anti-RDL og anti-mGlutR1), når udbredelsen af mGlutR1-CRISPR-Cas9 eller RDL-CRISPR-Cas9 var vellykket, blev niveauet af tilsvarende antistoffarvning også reduceret betydeligt. Det er også vigtigt at bemærke, at injektion i ocelli førte til en fordeling af CRISPR-Cas9 i hjernen, der ikke var homogen. Fordelingen varierede fra et minimalt område omkring ocelli og champignon krop til mange celler i hele hjernen. Cellernes variabilitet af mGlutR1- eller RDL-CRISPR-Cas9-optagelseskyldte varsandsynligvis på grund af variation i injektionerne. Vores data viser, at CRISPR-Cas9-systemet fungerer i honningbier, men injektionsmetoden skal forbedres for at reducere variationen i CRISPR-Cas9-optagelse på tværs af individuelle bihjerner. Inden for disse restriktioner, er det nu muligt at anvende denne teknik til at manipulere gener i voksne bier til adfærdsmæssige eksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af følgende priser til BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Peptidet og antistofferne for DmGluRA blev designet i laboratoriet Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankrig), da IS blev støttet af Programme d’Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 fra Fondation pour la Recherche Medicale. Vi er taknemmelige for Daniela Junqueira Marosi og Alex Hanter fra Integrated DNA Technology (IDT) for hjælp med udformningen af RDL guider og qPCR drop-off analyser.
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |