यहां प्रस्तुत एंटीबॉडी विशिष्टता का परीक्षण करने के लिए वयस्क मधुमक् खी मस्तिष्क में प्रोटीन के उत्पादन को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है।
क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/CRISPR-संबद्ध प्रोटीन 9 (Cas9) एक जीन संपादन तकनीक है जो जीन फ़ंक्शन के अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग की जाती है। हम इस अध्ययन में इस विधि का उपयोग कीट गाबाए रिसेप्टर सबयूनिट प्रतिरोध के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी की विशिष्टता की जांच करने के लिए करते हैं, जो डिएलड्रिन (आरडीएल) और एक मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर mGlutR1 (mGluRA) के खिलाफ विकसित किया गया है। एंटीबॉडी फल मक्खियों(ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर)के साथ-साथ मधुमक्खियों(एपीआईएस मेलिफेरा)के लिए विशिष्ट संयुग्मित पेप्टाइड्स के खिलाफ खरगोशों में उत्पन्न किए गए थे। हम मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों में इन एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया मधुमक् खी दिमाग में रिसेप्टर्स के वितरण का अध्ययन । एंटीबॉडी पेप्टाइड के खिलाफ शुद्ध थे और इम्यूनोब्लास्टिंग और पेप्टाइड कॉन्जुगेट्स के साथ प्रेक्टोप्शन की शास्त्रीय विधि के साथ परीक्षण किया गया था ताकि यह दिखाया जा सके कि एंटीबॉडी इसी पेप्टाइड कॉन्जुगेट्स के लिए विशिष्ट हैं जिसके खिलाफ उन्हें उठाया गया था। यहां हमने इसी रिसेप्टर के लिए डिजाइन किए गए गाइड आरएनए के साथ CRISPR-Cas9 इंजेक्शन के बाद मस्तिष्क 48 एच में प्रोटीन लक्ष्यों की कमी के लिए परीक्षण करने के लिए CRISPR-Cas9 तकनीक विकसित की। CRISPR-Cas9 विधि भी वयस्क मधुमक्खियों में व्यवहार विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है जब एक या कई जीन को संशोधित करने की जरूरत है ।
हाल ही में खोजे गए CRISPR/Cas9 प्रणाली एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग विभिन्न मॉडल प्रणालियों और जीवों में जीनोमिक डीएनए को बदलने के लिए किया गया है । इसने जीनोम संशोधन को पिछले तरीकों की तुलना में अधिक कुशल और मजबूत बनाकर जैव चिकित्सा अनुसंधान और प्रमुख तकनीकी सफलताओं को तेज कियाहै। एस पायोजीन बैक्टीरिया के मूल निवासी, सिस्टम एक Cas9 एंनोटुकलीज पर निर्भर करता है, जिसकी गतिविधि डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक (डीएसबी) की ओर जाता है, और एक गाइड आरएनए (gRNA) जो Cas9 प्रोटीन को एक विशिष्ट, अनुक्रम-निर्भर स्थान2पर निर्देशित करता है। CRISPR/Cas9 द्वारा उत्पन्न डबल-फंसे ब्रेक को गैर-अाहचार अंत में शामिल होने (NHEJ) के माध्यम से मरम्मत की जा सकती है, एक त्रुटि-प्रवण प्रक्रिया जो एक दाता टेम्पलेट मौजूद होने पर फ्रेमशिफ्ट, या होमोलॉजी सीधी मरम्मत का कारण बन सकती है । एसआरएनए में ही एक लक्ष्य-विशिष्ट CRISPR आरएनए (crRNA) और एक सार्वभौमिक ट्रांस-एक्टिविंग क्रैना (ट्रेसरना) शामिल है जिसे रासायनिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है और एक रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (आरएनपी)2,3के रूप में शुद्ध कै9 न्यूकलीज के साथ वितरित किया जा सकता है। ग्रेनए या कै9 न्यूकलीज की फ्लोरोसेंट लेबलिंग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी4के माध्यम से आणविक घटकों का पता लगाने और इंट्रासेलर दृश्य के लिए अनुमति दे सकती है।
हमारे वर्तमान कार्य में, हम वयस्क मधुमक् खी दिमाग में प्रोटीन के स्तर को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 प्रणाली का लाभ उठाते हैं। हमने मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर (mGluR) और एंटी-mGlutR1 रिसेप्टर एंटीबॉडी और गाबाए रिसेप्टर सबयूनिट आरडीएल और एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी का अध्ययन किया। हमने वयस्क मधुमक् खी के मस्तिष्क में प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए एक सरल विधि विकसित की और इसका उपयोग संबंधित प्रोटीन के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी के अतिरिक्त परीक्षणों को चलाने के लिए किया। CRISPR-Cas9 के फ्लोरेसेंस की निगरानी ने हमें प्रोटीन की कमी में शामिल क्षेत्रों और कोशिकाओं का अनुमान लगाने की अनुमति दी ।
इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी की भी विशेषता है जो खरगोशों में संयुग्मित पेप्टाइड के खिलाफ बनाए गए थे। मधुमक् खी जीनोम एक अत्यधिक संरक्षित AmgluRA (NCBI नामकरण के अनुसार mGlutR1 नाम) मेटाबोट्रोपिक ग्लूटामेट रिसेप्टर5एनकोड करता है। हनीबी mGlutR1 जीन NCBI डाटाबेस के अनुसार चार भविष्यवाणी की स्प्लिस वेरिएंट है । यह बताया गया है कि यह प्यूपल और वयस्क मधुमक्खी दोनों चरणों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में व्यक्त किया जाता है और यह दीर्घकालिक स्मृति गठन5में शामिल है। mGlutR1 के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी मधुमक्खियों में सीखने और स्मृति प्रक्रिया में ग्लूटामर्गिक प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक उपकरण हो सकता है।
हमारे अध्ययनों में, हमने एपिस् मेलिफेरा आरडीएल रिसेप्टर उपइकान से संयुग्मित पेप्टाइड्स के साथ प्रतिरक्षित खरगोशों में विकसित एंटी-आरडीएल एंटीबॉडी की भी विशेषता है। मधुमक् खी Rdl जीन, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI डाटाबेस), 14 स्प्लिस वेरिएंट की भविष्यवाणी की है। एनसीबीआई डाटाबेस AF094822.1 में आंशिक रूप से क्लोन किए गए टुकड़े की सूचना मिली है। आरडीएल रिसेप्टर फंक्शन और इसके फिजियोलॉजी का अच्छी तरह से अध्ययन कीड़ोंमें 6,7,8, मधुमक्खियोंसहित 9,10,11. एंटी-आरडीएल के खिलाफ विकसित एंटीबॉडी मधुमक्खियों में सीखने और स्मृति प्रक्रिया में गैबाएर्गिक प्रणाली का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक उपकरण हो सकता है।
ऑक्टोपामाइन और टायरामीन रिसेप्टर्स की भूमिका पर एक पूर्व अध्ययन में मस्तिष्क में इंजेक्शन दिया गया था , जिसके बाद पश्चिमी दाग12,13द्वारा प्रोटीन की मात्रा का परीक्षण किया गया था । हालांकि, आरएनएआई की कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। आरएनएआई इंजेक्शन के बाद केवल एक कम समय की खिड़की होती है जिसके भीतर प्रोटीन की कमी होती है13. CRISPR-Cas9 हाल ही में मधुमक् खी भ्रूण में इस्तेमाल किया गया था को नष्ट करने या पूरे पशु14,15,16में जीन को संशोधित । हमने वयस्क मधुमक् खी में प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए CRISPR-Cas9 के उपयोग की सूचना दी। हमने मधुमक्खियों के लिए यह दृष्टिकोण विकसित किया क्योंकि यह नियंत्रित प्रयोगशाला स्थितियों17के तहत सीखने और स्मृति के व्यवहार अध्ययन के लिए इसे जोड़े रखने की क्षमता है ।
वर्तमान काम में, हमने दो रिसेप्टर्स के खिलाफ एंटीबॉडी विकसित की और प्रोटीन CRISPR-Cas9 इंजेक्शन द्वारा कम होने के बाद वयस्क मधुमक्खी मस्तिष्क वर्गों पर उनका परीक्षण किया। साथ ही, हमने एक प्रयोगात्मक डिजाइन की स्थापना की जो व्यवहार प्रयोगों के लिए विधि के उपयोग की अनुमति देता है।
विरोधी RDL और विरोधी mGlutR1 का लक्षण वर्णन
सबसे पहले, हमने फिक्स्ड मधुमक् खी दिमाग के स्लाइस पर इम्यूनोब्लॉट और प्री-एडोप्शन द्वारा एंटी-आरडीएल और एंटी-ग्लूटर1 एंटीबॉडी की विशेषता थी। प्रत्येक एंटीबॉडी को अपने सभी ज्ञात आइसोफॉर्म को पहचानने के लिए बनाया गया था, और पश्चिमी विश्लेषण से पता चलता है कि वे उन बैंडों को पहचानते हैं जो उनके अनुमानित आणविक वजन के अनुरूप हैं। इसके बाद, दोनों एंटीबॉडी को संयुग्मित पेप्टाइड द्वारा अवरुद्ध कर दिया गया था जिसके खिलाफ उन्हें मधुमक् खी मस्तिष्क वर्गों पर उत्पादित किया गया था।
हमारे अध्ययन में पहला उद्देश्य यह स्थापित करना था कि विशिष्ट संयुग्मित पेप्टाइड के खिलाफ उत्पादित एंटीबॉडी निश्चित मस्तिष्क ऊतक में इसके प्रोटीन के लिए विशिष्ट हैं। इसी उद्देश्य से हमने CRISPR-Cas9 प्रणाली का लाभ उठाया । हमने मधुमक् खी RDL और mGlutR1 के लिए विशिष्ट गाइड डिजाइन किए हैं और उनमें से प्रत्येक का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोब ATTO550 के साथ लेबल CRISPR-Cas9 बनाने के लिए किया। प्रत्येक रिसेप्टर के लिए, हमने ओसेली में तीन अलग-अलग CRISPR-Cas9 रिपोन्यूक्लियोप्रोटीन का मिश्रण इंजेक्ट किया ताकि हमारे डिजाइन किए गए Cas9 सिस्टम को लेने वाली कोशिकाओं में संबंधित जीन को नष्ट करके वयस्क मधुमक् खी मस्तिष्क में लक्षित प्रोटीन की मात्रा को कम किया जा सके। अपने अध्ययन में हमने यह कदम पूरा किया।
इन प्रयोगों की सफलता के लिए पहले महत्वपूर्ण चरणों में से एक उपयुक्त गाइड आरएनए डिजाइन कर रहा है। हम शुरुआत, मध्य और जीन अनुक्रम के अंत में स्थित पांच गाइड आरएनए को डिजाइन करने की सलाह देते हैं। हमारे प्रारंभिक कार्य में, हमने उन्हें तीन से पांच मधुमक्खियों पर विभिन्न संयोजनों में परीक्षण किया। हमने इंजेक्शन की विभिन्न सांद्रता के साथ-साथ इंजेक्शन के बाद के समय और इंजेक्शन में आरएनपी के विभिन्न मिश्रणों की भी कोशिश की। हमने दिमाग को विच्छेदित किया और उन्हें एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 एंटीबॉडी का उपयोग करके संसाधित किया। इन प्रारंभिक परीक्षणों में, हमने इंजेक्शन के लिए उपयुक्त संयोजन, इंजेक्शन के बाद का समय, साथ ही इंजेक्शन के लिए CRISPR-Cas9 की एकाग्रता और मात्रा स्थापित की। ये प्रारंभिक परीक्षण उन प्रयोगों को स्थापित करने का आधार थे जो हमने यहां विस्तार से वर्णित किए थे ।
उद्देश्य दो गुना था: 1) एक मधुमक्खी में प्रदर्शित करने के लिए कि हमारे एंटीबॉडी धुंधला CRISPR-Cas9 और 2 के साथ उपचार के बाद कम किया गया था) व्यवहार अध्ययन के लिए सबसे अच्छा प्रयोगात्मक शर्तों के माध्यम से काम करने के लिए । इस प्रकार, हम बताते हैं कि यदि इंजेक्शन के बाद कई सेल नाभिक में CRISPR-Cas9 48 एच शामिल हैं, तो एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1 धुंधला की कमी महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह दर्शाता है कि परीक्षण किए गए एंटीबॉडी विशेष रूप से मधुमक् खी मस्तिष्क की तैयारी में mGlut1 और RDL प्रोटीन को पहचानते हैं और उनका उपयोग मधुमक् मस्तिष्क में स्थानीयकरण अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
व्यवहार अध्ययन के लिए प्रायोगिक सेटिंग CRISPR-Cas9
इसके बाद, हमने प्रयोगों की स्थापना की ताकि CRISPR-Cas9 का उपयोग व्यवहार अध्ययनों में किया जा सके। नियंत्रण और प्रायोगिक उपचार के लिए आठ या नौ मधुमक्खियों को एकत्र किया गया । वे पहले और इंजेक्शन के बाद व्यवहार का परीक्षण किया गया, और फिर उनके दिमाग ATTO550 और/या इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों है कि लक्ष्य प्रोटीन की कमी दिखाई निर्धारित किया गया । यहां यह ध्यान रखना आवश्यक है कि प्रयोगों के एक सेट के लिए ली गई मधुमक्खियों की संख्या नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों के लिए 8-9 मधुमक्खियों से अधिक तक सीमित नहीं थी। इस तरह दोनों स्थितियों का परीक्षण एक ही दिन किया जा सकता है । इसके अलावा, एक बार जब हमने इंजेक्शन के लिए CRISPR-Cas9 मिश्रण तैयार किया, तो हम उन्हें कभी नहीं सील करते हैं। CRISPR-Cas9 मिश्रण शक्ति में परिवर्तन नहीं किया जब एक पंक्ति में 3 दिन का इस्तेमाल किया और 4-8 डिग्री सेल्सियस पर रखा । हालांकि हमने 3 दिन बाद भी इसका परीक्षण नहीं किया।
जैसा कि हमने प्रायोगिक इंजेक्शन के दोनों सेटों के लिए परिणाम अनुभाग में वर्णित किया है और दोनों एंटीबॉडी के लिए, 16 परीक्षण से केवल तीन मधुमक्खियों ने मशरूम शरीर, प्रोटोसेरेब्रम और एंटीनाल लोब में एक बड़ा वितरण ATTO550 दिखाया। अन्य सभी मधुमक्खियों में, CRISPR-Cas9 का वितरण मशरूम शरीर, केंद्रीय परिसर और/या पीछे प्रोटोसेरेब्रम तक सीमित था । किसी भी व्यवहार अध्ययन के लिए यह समझना आवश्यक है कि इस इंजेक्शन विधि का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन की कमी केवल अधिकांश मधुमक्खियों में मशरूम शरीर तक सीमित हो जाएगी। यह एंटीनाल पालि या उपसोफेगलियन तक विस्तारित नहीं होगा। इस प्रकार, इंजेक्शन तकनीक है कि हम उपयोग के व्यवहार प्रयोगों में मशरूम शरीर और केंद्रीय परिसर में रिसेप्टर्स की कमी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जबकि CRISPR-Cas9 शुरू करने का एक अलग तरीका अंय मस्तिष्क क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए और अधिक उपयुक्त होगा ।
निष्कर्ष में, हमारे अध्ययन मस्तिष्क में एंटीबॉडी धुंधला के लिए एक नियंत्रण के रूप में CRISPR-Cas9 के सफल आवेदन का प्रदर्शन किया । एंटीबॉडी (एंटी-आरडीएल और एंटी-mGlutR1) के लिए, जब mGlutR1-CRISPR-Cas9 या RDL-CRISPR-Cas9 का तेज सफल रहा, तो इसी एंटीबॉडी स्टेनिंग का स्तर भी काफी कम हो गया था। इसके अलावा, यह ध्यान रखना आवश्यक है कि ओसेली में इंजेक्शन के कारण मस्तिष्क में CRISPR-Cas9 का वितरण हुआ जो समरूप नहीं था। वितरण पूरे मस्तिष्क में कई कोशिकाओं के लिए ocelli और मशरूम शरीर के आसपास के एक ंयूनतम क्षेत्र से विविध । इंजेक्शन में भिन्नता के कारण कोशिकाओं द्वारा mGlutR1-या RDL-CRISPR-Cas9 तेज की परिवर्तनशीलता की संभावना थी । हमारे डेटा से पता चलता है कि CRISPR-Cas9 प्रणाली मधुमक्खियों में काम करता है, लेकिन इंजेक्शन की विधि को बेहतर बनाने के लिए व्यक्तिगत मधुमक्खी दिमाग भर में CRISPR-Cas9 तेज की परिवर्तनशीलता को कम करने की जरूरत है । इन प्रतिबंधों के भीतर, अब व्यवहार प्रयोगों के लिए वयस्क मधुमक्खियों में जीन में हेरफेर करने के लिए इस तकनीक को नियोजित करना संभव है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को बीएचएस: ह्यूमन फ्रंटियर्स साइंस प्रोग्राम को निम्नलिखित पुरस्कारों द्वारा समर्थित किया गया था; एनआईएच एनआईएमएस (आर01 जीएम 113967); एनएसएफ आइडियालैब (1556337) । डीएमग्लूरा के लिए पेप्टाइड और एंटीबॉडी प्रयोगशाला में डिजाइन किए गए थे डॉ सर्ज बिरमैन (मार्सिले, ल्यूमिनी, फ्रांस) जब है कार्यक्रम डी ‘ Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 द्वारा समर्थित था Fondation डालना ला Recherche चिकित्सा । हम डीआरएल गाइड और क्यूपीसीआर ड्रॉप-ऑफ परखों के डिजाइन के साथ मदद के लिए इंटीग्रेटेड डीएनए टेक्नोलॉजी (आईडीटी) से डेनिएला जंक्वेरा मारोसी और एलेक्स हैंटर के लिए आभारी हैं ।
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |