Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.
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Articolo metodologico
Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni tra i recettori accoppiati alle proteine G (GLR) e gli arresti z sono processi vitali con implicazioni fisiologiche di grande importanza. Attualmente, la caratterizzazione di nuovi farmaci verso le loro interazioni con gli arresti z e altre proteine citosoliche è estremamente preziosa nel campo della scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo studio dell'agonismo di parte della GPCR. Qui, mostriamo l'applicazione di un nuovo saggio di complemento strutturale per monitorare con precisione le interazioni recettore-arresto in sistemi viventi in tempo reale. Questo metodo è semplice, preciso e può essere facilmente esteso a qualsiasi GPCR di interesse e ha anche il vantaggio di superare interazioni non specifiche a causa della presenza di un promotore di bassa espressione presente in ogni sistema vettoriale. Questa analisi di complemento strutturale fornisce caratteristiche chiave che consentono un monitoraggio accurato e preciso delle interazioni recettore-z-arrestin, rendendolo adatto nello studio dell'agonismo distorto di qualsiasi sistema GPCR e del GPCR c-terminus 'phosphorylation diversi codici 'scritti da diverse chinasi GPCR (GRK) e modifiche post-traduzionali di arrestini che stabilizzano o destabilizzano il complesso recettore-arresto.
Introduzione
I GPD rappresentano l'obiettivo di quasi il 35% dei farmaci attuali sul mercato1,2 e una chiara comprensione della loro farmacologia è cruciale nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici3. Uno degli aspetti chiave nella scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo sviluppo di agonisti di parte è la caratterizzazione di nuovi ligandi verso le interazioni recettore-arresto4 e le interazioni di arresto-arresto con altre proteine citosoliche come come clathrin5.
È stato documentato che la segnalazione dipend....
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Protocollo
1. Strategia di progettazione dei primer
- Progettare i primi geni di interesse nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT].
- Selezionare almeno uno di questi tre siti come uno dei due enzimi di restrizione univoci necessari per la clonazione direzionale a causa della presenza di un codon di stop in-frame che divide il sito di multicloning come illustrato nella Figura 111.
- Incorporare la sequenza dei nucleotidi nei primer come illustrato nella Tabella 1 per codificare i residui del linker visualizzati in rosso nella ....
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Risultati
Utilizzando la procedura qui presentata, sono state monitorate le interazioni tra un prototipo di GPCR e due isoformi di arresto z. Glucagon come il recettore peptide (GLP-1r) sono stati realizzati utilizzando primer contenenti siti di restrizione enzimatica NheI ed EcoRI e clonati nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mentre, nel caso degli arresti zin, due vettori aggiuntivi sono stati, due vettori aggiuntivi sono stati ha usato pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilizzando siti di restrizio.......
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Discussione
Utilizzando il metodo qui presentato, le interazioni tra qualsiasi GPCR e .-arrestin1 1/2 possono essere monitorate in sistemi viventi in tempo reale utilizzando questo saggio di complemento strutturale GPCR-arresto-arresto. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare il reclutamento differenziale di z-arrestin tra le due isoformi z-arrestin dal GLP-1r (Un prototipo di GPCR di classe B), abbiamo anche osservato una dissociazione del complesso recettore-z-arrestin pochi minuti dopo aver raggiunto il massimo segn.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca (NRF- 2015M3A9E7029172) della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero della Scienza, iCT e Pianificazione Futura.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antibiotici: penicillina, streptomicina | Welgene | LS202-02 | Penicillina/streptomicina |
| incubatore batterico | JEIO Tech | IB-05G | Incubatore (camicia d'aria), |
| base Terreno di coltura cellulare | Welgene | LM 001-05 | DMEM Terreno di coltura cellulare |
| Terreno di trasfezione per colture cellulari | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X terreno |
| Incubatore a CO2 | NUAIRE | NU5720 | Incubatore a CO2 a calore diretto |
| Bagno d'acqua digitale | Lab Tech | LWB-122D | d'acqua digitale da laboratorio tech |
| Lettura di prova della DNA polimerasi | ELPIS Biotech | EBT-1011 | Kit |
| purificazione del DNA | della CMP0112 | Cosmogenetech | miniprepLaboPass Kit di purificazione del plasmide Mini |
| DNA Taq polimerasi | Enzimi | P750 | nTaq DNA polimerasi |
| Restrizione enzimatica BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Tampone di restrizione enzimatica | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Tampone |
| Restrizione enzimatica EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Restrizione enzimatica NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Restrizione enzimatica XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Siero fetale bovino | Gibco Canada | 12483020 | Siero fetale bovino |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA MiniKit |
| Ligasi | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligasi |
| Microscopio ottico | Olympus | CKX53SF | CKX53 Microscopio Reagente |
| trasfezione lipidica | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 |
| Luminometro | Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Lettori di micropiastre multimodali |
| Sistema NanoBiT Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Sistema iniziale | |
| Substrato nanoluciferasi | Promega | N2012 | Nano-Glo Sistema di analisi di cellule vive |
| PCR Termociclatore | Eppendorf | 6336000015 | Master cycler Nexus SX1 |
| Poli-L-lisina | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Soluzione di poli-L-lisina |
| Tripsina EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| Coltura di cellule bianche Piastre a 96 pozzetti | Corning | 3917 | Piastra di analisi Piastra a 96 pozzetti |
Riferimenti
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR ....
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