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Artículo de método

Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos

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DOI:

10.3791/59994

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28 de junio de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Korea University

En este artículo

Resumen

Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.

Resumen

Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores--arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la "fosforilación" de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos' escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.

Introducción

Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.

Se ha documentado que la señalización dependiente de la arrestina desempeña un papel clave en los trastornos neurológicos como el trastorno bipolar, la depresión mayor y la esquizofrenia6 y también los efectos secundarios graves en algunos medicamentos como la morfina7.

Los métodos actuales utilizados para monitorear estas interacciones generalmente no representan los niveles endógenos reales de las proteínas en estudio, en algunos casos muestran señal débil, fotoblanqueo y dependiendo del GPCR podría ser técnicamente difícil configurar8. Este novedoso ensayo de complementación estructural utiliza vectores promotores de baja expresiónpara imitar los niveles fisiológicos endógenos y proporciona una alta sensibilidad en comparación con los métodos actuales 9. Usando este enfoque, fue posible caracterizar fácilmente las interacciones de Galanin receptor---arrestin1/2 y también de la arlatina10. Esta metodología puede ser ampliamente utilizada para cualquier GPCR de particular interés donde las arrestinas juegan una función fisiológica clave o su señalización es relevante en algunas enfermedades.

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Protocolo

1. Estrategia de diseño de primer

  1. Imprimaciones de diseño para introducir genes de interés en pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectores.
  2. Seleccione al menos uno de estos tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional debido a la presencia de un codón de parada en trama que divide el sitio de multicloning como se muestra en la Figura 111.
  3. Incorporar la secuencia de nucleótidos en las imprimaciones como se muestra en la Tabla 1 para codificar los residuos del vinculador mostrados en rojo en la Tabla 211.
  4. Para los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT], asegúrese de que la imprimación de 5o contiene un codón ATG y una potente secuencia de consenso Kozak (GCCGCCACC).
  5. Para los vectores pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT], asegúrese de que la imprimación de 3o contenga un codón de detención.
    NOTA: Cada vector contiene el promotor HSV-TK para minimizar la asociación inespecífica y reducir los artefactos experimentales, también cada vector tiene un casete de expresión para la resistencia a la ampicilina en bacterias.

2. PCR

  1. Configure y ejecute reacciones de PCR para amplificar el ADN de inserción del gen de interés utilizando las imprimaciones diseñadas a partir del paso 1. Es importante utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad para minimizar las mutaciones.
  2. Utilice exactamente el siguiente orden para preparar 50 sL de reacción PCR. Añadir 35,5 l de agua destilada, 5 l de tampón de polimerasa de 10x, 5 l de mezcla dNTP (2,5 ml cada uno), 1 l de plantilla de plásmido (200 ng/L), 1,25 l de imprimaciones delanteras y inversas (10 m) y 1 l de alta fidelidad de polímero (5 U/L).
  3. Usando un termociclador configurar el siguiente programa de amplificación de ADN.
    1. Desnaturalidad a 95oC durante 5 min.
    2. Repetir 25 veces el siguiente ciclo térmico: 95 oC para 30 s, 60 oC durante 1 min, 72 oC durante 2 min por 1 kbp para ser amplificado.
    3. Ejecuta una extensión final a 72oC durante 10 min.
    4. Sujete las muestras a 4oC dentro del termociclador.
      NOTA: Se recomienda utilizar una polimerasa de alta fidelidad para minimizar las mutaciones puntuales, especialmente las que se producen durante la amplificación de secuencias largas. A medida que el amplificador se hace más largo, el grado de precisión en la replicación del ADN disminuye. Para la reacción PCR, elija la temperatura de recocido basada en la temperatura de fusión de la región donde los oligos se hibridan directamente con la plantilla de ADN y no con toda la secuencia de la imprimación.
  4. Purificación de productos PCR
    1. Aísle el producto PCR del resto de la reacción pcR utilizando un kit de un fabricante de preferencia12. El producto PCR ya está listo para la digestión de restricciones.

3. Digestión del ADN

  1. Para la digestión del producto PCR, prepare 50 ml de reacción de digestión de la siguiente manera.
    1. Con un tubo de 1,5 ml, añadir 12 ml de agua destilada.
    2. Añadir 5 l de tampón de 10x con la mejor compatibilidad con ambas enzimas de restricción.
    3. A partir del paso 2.4 añadir 30 l de producto PCR
    4. Por último, agregue 1,5 l de cada enzima de restricción.
    5. Mezclar brevemente por vórtice e incubar a 37,5 oC durante la noche.
  2. Para el plásmido receptor, prepare 50 ml de reacción de digestión de la siguiente manera:
    1. Con un tubo de 1,5 ml, añadir 23 ml de agua destilada.
    2. Añadir 5 l de tampón de 10x con la mejor compatibilidad con ambas enzimas de restricción.
    3. Añadir 15 ml de plásmido receptor (200 ng/L).
    4. Añadir 1,5 ml de cada enzima de restricción.
    5. Mezclar brevemente por vórtice e incubar a 37,5 oC durante la noche.
      NOTA: Es importante utilizar 3 g de plásmido receptor para obtener material suficiente después de la purificación del gel de agarosa de ADN. También es relevante dejar las digestiones del ADN durante la noche utilizando ambas enzimas para obtener una alta eficiencia de clonación.

4. Purificación y clonación de gel de agarosa de ADN

  1. Preparar un gel de agarosa del 1% para ejecutar el plásmido de ADN digerido e inserciones y proceder a cortar las bandas correspondientes. Una vez purificado el vector correspondiente y las bandas de inserción12, determine la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.
  2. Realice la ligadura de ADN para fusionar el inserto con el plásmido receptor.
  3. Preparar reacciones de ligadura de alrededor de 100 ng de ADN total incluyendo 50 ng de vector plásmido.
  4. Configurar la relación plásmido-inserción del recipiente de aproximadamente 1:3; se puede calcular utilizando una calculadora de inserción vectorial13.
  5. Configure controles negativos en paralelo. Por ejemplo, una ligadura del ADN plásmido receptor sin ningún inserto proporcionará información sobre cuánto fondo de plásmido receptor no digerido o autoligante está presente.

5. Transformación de clones

  1. Colocar un tubo de células competentes de DH5 desde el congelador a -80 oC y transferirlo inmediatamente sobre hielo durante 20 minutos.
  2. Después de ese tiempo, tomar 55 sl de células competentes de DH5 y añadir 4 l de reacción de ligadura y mezclar moviendo el tubo y almacenar en hielo durante 45 min.
  3. Colocar el tubo en un baño de agua previamente calentado a 42 oC durante exactamente 48 s e inmediatamente volver a poner los tubos en hielo durante otros 3 minutos.
  4. Añadir 600 l de caldo de luria (LB) medio previamente calentado a 37,5 oC e incubar con agitación durante 1 hora a 200 rpm.
  5. Transfiera 200 ml a una placa de agar que contenga ampicilina 100 g/ml y se extienda suavemente sobre la superficie con el líquido se absorbe principalmente.
  6. Incubar las placas durante la noche para ver las colonias a la mañana siguiente. El plásmido receptor en la placa de inserción debe tener significativamente más colonias que la placa sola del plásmido receptor.

6. Aislamiento del plásmido terminado

  1. Recoger 3-10 colonias bacterianas individuales y transferirlas a 1 ml de medio LB que contenga ampicilina (100 g/ml) e incubar durante 6 h.
  2. Tomar 200 ml de suspensión bacteriana y transferirlo a 5 ml de medio LB que contenga la misma concentración de ampicilina que en el paso 6.1 e incubar durante la noche a 37,5 oC con agitación a 200 rpm.
  3. Usando una purificación de kit de ADN miniprep, realice purificaciones de ADN miniprep utilizando 5 ml de LB cultivado durante la noche siguiendo las instrucciones del fabricante14.
  4. Para identificar las ligaduras exitosas, configure las reacciones de PCR de la misma manera que en la sección 2 utilizando el ADN obtenido del paso 6.3 como plantilla con las mismas imprimaciones que en la sección 2 durante la primera PCR. Los clones positivos producirán productos DE PCR con el tamaño correspondiente.
  5. Después de una gran purificación de ADN de preparación de los clones positivos, llevar a cabo una digestión de restricción diagnóstica de 500 ng de ADN purificado con las enzimas utilizadas durante el paso de clonación y ejecutar los productos digeridos en un gel de agarosa del 1%. Debe haber dos bandas: una del tamaño del vector y otra del tamaño de la nueva plaquita.
  6. Verifique la secuencia de construcción mediante la secuenciación utilizando los siguientes imprimadores: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtagcccctcgaac-3' y reverse 5'-gcatttttttcactgcattctagtt-3'.
    NOTA: Cuando el ADN se replica mediante PCR, siempre existe la posibilidad de errores durante la amplificación, incluso cuando se utiliza una polimerasa de alta fidelidad, por lo tanto es muy importante secuenciar las construcciones finales.

7. Transfección y expresión proteica

  1. En una placa de pozo blanca 96 previamente recubierta de poli-L-lisina, realice la sembración celular un día antes de la transfección a 2,5 x 104 células por pocto utilizando el medio modificado de Eagle de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml penicilina G, y 100 g/ mL estreptomicina.
  2. Utilice sólo los 60 pozos interiores para minimizar el potencial de gradientes térmicos a través de la placa y los efectos de borde de evaporación. Añadir 200 l de agua destilada estéril a los 36 pozos exteriores y 150 l en los espacios entre pozose incubar durante la noche a 37,5oC y el 5% de CO2.
  3. A la mañana siguiente realizar la transfección utilizando 100 ng de ADN total (50 ng cada construcción).
  4. Configure cuatro combinaciones de plásmidos diferentes (receptor:-arrestin) de acuerdo con la Figura 2b.
  5. Para cada combinación de plásmidos, utilice 20 ml de medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES utilizando 0,3 ml de reactivo de transfección lipídica por poca.
  6. Añadir 20 ml de mezcla lipidic de reactivo-ADN de transfección a cada pocto y mezclar la placa en círculos durante 10 s.
  7. Cambiar el medio fresco después de 6 horas de incubación a 37,5oC y 5% de CO2.
  8. Incubar la placa durante 24 h a 37,5oC y 5%co2.

8. Monitoreo de las interacciones entre el receptor y la arrestina 1/2 en las células HEK293

  1. Aspirar el medio y añadir 100 l de medios esenciales mínimos de Eagle modificado sin búfer con HEPES a cada poca y dejar que la placa se estabilice en RT durante 10 min.
  2. Preparar el sustrato de furimazine combinando 1 volumen de 100x de sustrato con 19 volúmenes de LCS Dilution Buffer (una dilución de 20 veces)11,creando un stock de 5x para mezclar con el medio de cultivo celular.
  3. Añadir 25 s de furimazine 5x a cada pocto y mezclar suavemente en círculos durante 10 s.
  4. Mida la luminiscencia durante 10 min para la estabilización de la señal en RT.
    NOTA: Al utilizar esta señal de línea base para normalizar la respuesta de cada pozo, ayudará a reducir la variabilidad causada por las diferencias en el número de células chapadas por pozo, también las diferencias en la eficiencia de la transfección, etc. Una vez calculada, promediar la respuesta normalizada de los pozos de réplica para un tratamiento farmacológico dado.
  5. Prepare la solución de ligando 13.5x en los medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES.
  6. Para experimentos a temperatura ambiente con 10 sl de adición de ligandos de 13,5x, agregue los compuestos utilizando inyectores o una pipeta multicanal y mezcle la placa a mano o utilizando un agitador orbital (20 s a 200 rpm).
  7. Para experimentos a 37,5 oC con 10 oC de adición de ligandos de 13,5x, utilice inyectores para dispensar compuestos y mezcle utilizando el agitador orbital del instrumento. En caso de no utilizar inyectores, retire la placa del luminómetro, añada los ligandos y mezcle la placa a mano o utilizando un agitador orbital (20 s a 200 rpm).
    NOTA: Utilice inyectores y una coctelera dentro del instrumento de detección para minimizar las fluctuaciones de temperatura asociadas con la extracción de la placa del luminómetro. Para este ensayo se pueden utilizar luminómetros de sobremesa estándar. Utilice un tiempo de integración de 0,25–2 s.

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Resultados

Mediante el procedimiento que se presenta aquí, se supervisaron las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas de arrestina. Las construcciones de glucagón como el receptor de péptidos (GLP-1r) se hicieron utilizando imprimaciones que contenían sitios de restricción de enzimas NheI y EcoRI y se clonaron en los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y p...

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Discusión

Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR--arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor---arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscente.

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antibióticos penicilina estreptomicinaWelgeneLS202-02Penicilina/estreptomicina
Incubadora bacterianaJEIO TechIB-05GIncubadora (Air-Jacket), básica
Medio de cultivo celularWelgeneLM 001-05DMEM Medio de cultivo celular
Medio de transfección de cultivo celularGibco31985-070Optimem 1X medio
Incubadora de CO2NUAIRENU5720Incubadora de CO2 de calor
directo Baño de agua digitalLab TechLWB-122DBaño de agua digital técnica de laboratorio
Lectura de pruebas de ADN polimerasaELPIS BiotechEBT-1011PfU Polimerasa
ADN kit de purificación de ADNCosmogenetechCMP0112miniprepLaboPass Purificartion Kit de purificación Mini
ADN Mini ADN Taq PolimerasaEnzinomíaP750nTaq ADN polimerasa
Restricción enzimática BglIINew England BiolabsR0144LBglII
Tampón de restricción enzimáticaNew England BiolabsB72045CutSmart 10X Tampón
Restricción enzimática EcoRINew England BiolabsR3101LEcoRI-HF
Restricción enzimática NheINew England BiolabsR01315NheI
Restricción enzimática XhoINew England BiolabsR0146LXhoI
Suero fetal bovinoGibco Canadá12483020Suero fetal bovino
Gel/PCR DNA MiniKitReal Biotech CorporationKH23108HiYield Gel/PCR DNA
MiniKit LigasaELPIS BiotechEBT-1025T4 DNA Ligase
Microscopioóptico OlympusMicroscopio CKX53SF CKX53 Reactivo
transfección lipídicaOlympus Invitrogen11668-019Luminómetro Lipofectamine 2000
Biotek/Fisher Scientific12504386Synergy 2 Lectores de microplacas multimodo
Sistema NanoBiTPromegaN2014NanoBiT PPI MCS Starter System
Sustrato de nanoluciferasaPromegaN2012Nano-Glo Sistema de ensayo de células vivas
PCR TermocicladorEppendorf6336000015Maestro ciclador Nexus SX1
Poly-L-lisinaSigma AldrichP4707-50MLSolución de poli-L-lisina
Tripsina EDTAGibco25200-056Trysin EDTA 10X
Cultivo de glóbulos blancos Placas de 96 pocillosCorning3917Placa de ensayo Placa de 96 pocillos
de cultivo celular de de

Referencias

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