Detta protokoll är utformat för att bedöma Drosophilas livskraft vid varje utvecklingsstadium, från embryo till vuxen. Metoden kan användas för att bestämma och jämföra lönsamheten för olika genotyper eller tillväxtförhållanden.
I Drosophila melanogasteranvänds lönsamhetsanalyser för att fastställa lämpligheten hos vissa genetiska bakgrunder. Alleliska variationer kan resultera i partiell eller fullständig förlust av lönsamhet i olika utvecklingsstadier. Vårt labb har utvecklat en metod för att bedöma lönsamheten i Drosophila från embryo till fullt mogen vuxen. Metoden bygger på att kvantifiera det antal avkomman som finns i olika stadier under utvecklingen, med början i kläckade embryon. Efter att embryona har kvantifierats räknas ytterligare stadier, inklusive L1/L2, puppor och mogna vuxna. Efter att alla stadier har undersökts används en statistisk analys som Chi-Square-testet för att avgöra om det finns en signifikant skillnad mellan start antalet avkomma (kläckta embryon) och senare stadier som kulminerar i det observerade antalet vuxna. således avvisa eller acceptera nollhypotesen (att antalet kläckta embryon kommer att vara lika med antalet larver, puppor, och vuxna registreras under utvecklingsstadierna). Den främsta fördelen med denna analys är dess enkelhet och noggrannhet, eftersom det inte kräver ett embryo skölj för att överföra dem till maten injektionsflaskan, undvika förluster från tekniska fel. Även om det protokoll som beskrivs här inte direkt undersöker för L2/L3 larver, kan ytterligare steg läggas till för att redovisa dessa. Jämföra antalet kläckta embryon, L1, puppor, och vuxna kan hjälpa till att avgöra om lönsamheten var äventyras under L2/L3 stadier för ytterligare studier (användning av färgade livsmedel hjälper till med visuell identifiering av larver). Sammantaget kan denna metod hjälpa Drosophila forskare och lärare avgöra när lönsamheten äventyras under flyga livscykel. Rutinmässig bedömning av bestånd med hjälp av denna analys kan förhindra ackumulering av sekundära mutationer som kan påverka fenotyp av den ursprungligen isolerade Mutant, särskilt om de ursprungliga mutationer påverkar Fitness. Av denna anledning, vårt labb upprätthåller flera kopior av var och en av våra DM ime4 alleler och rutinmässigt kontrollerar renhet av varje bestånd med denna metod utöver andra molekylära analyser.
Livslängden påverkas av genetiska och icke-genetiska faktorer. I standard Lab tillväxtförhållanden vid rumstemperatur, vårt labb har observerat betydande variation av kondition och lönsamhet bland olika DM ime4 alleler odlas under identiska förhållanden (figur 1 och kompletterande siffror). Genomförbarhet studier görs ofta för att undersöka effekterna av en viss allel kombination eller tillväxtvillkor i populationsgenetiska studier1,2,3,4. Detaljerade analyser av lönsamheten inom en icke-komplementär grupp av mutationer är dock svåra att hitta i den vetenskapliga litteraturen. En allel brukar märkas “icke-väsentliga” om forskaren finner ett fåtal individer homozygot för att allel inom livsmedels flaskan som inrymmer balanserade beståndet5,6. Emellertid, noggrann Chi-Square analyser för att bedöma om dessa homozygoter uppstår vid de förväntade Mendelian nyckeltal rapporteras inte5,6. Den mest tillåtande temperaturen för alla Drosophila lager är rumstemperatur (22-23 ° c) och, med lämpliga näringsämnen, livscykeln av Wild-Type flugor tar cirka tolv dagar att slutföra7,8. Eftersom varaktigheten av varje utvecklingsstadium av vildtyp Drosophila är känd7,8, kan den metod som beskrivs i denna rapport användas för att undersöka om Drosophila stammen under studie är lämplig i varje skede i jämförelse med en kontroll som är lämplig för den genetiska bakgrunden testad. I motsats till studier som fokuserar på en specifik aspekt av utveckling9, ger detta protokoll ett praktiskt sätt att bedöma lönsamheten i olika utvecklingsstadier.
I vårt labb, detta protokoll används för att bedöma lönsamheten för bestånd som är bristfällig för Drosophila inducerare av Meiosis 4 (DM ime4). DM ime4 är en essentiellgen 10 som kodar ett RNA-metyltransferas med kritiska roller i RNA-metabolism i Drosophila och andra flercelliga organismer5,6,10, elva , 12 , 13 , fjorton . För att snabbt utvärdera nya alleler av DM-ime4 som genererats via CRISPR/Cas9 (kompletterande siffror) utfördes en analys av slutpunkts genomförbarhet som endast räknade vuxna avkomman som producerats inom injektionsflaskor med balanserade bestånd (figur 1). Några av de bestånd som används beskrevs i tidigare DM ime4 rapporter5,6. Homozygot mutanter uppstod vid sub-Mendelian nivåer, som bestäms av Chi-kvadrat analyser (figur 1 och kompletterande material). För att bedöma om dessa lägre antal än väntat berodde på färre embryon som lades, eller färre kläckta embryon, eller förlust av livskraft i L1/L2 eller puppor, utvidgade vi spårningen till att omfatta räknas vid var och en av dessa utvecklingsstadier (figur 2, Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, figur 8och figur 9).
Här beskriver vi metoden med Wild-Type (OreR) flugor. För att empiriskt testa denna metod för användning med andra genetiska bakgrunder eller Drosophila arter, rekommenderar vi att använda OreR som referens och justera tidspunkter enligt den experimentella organismen. Protokollet utvärderades ytterligare för att bedöma lönsamheten för avkomman som genererats genom att korsa Virgin Wild-Type honor med hanar från en heterozygot DM ime4 Mutant Stock5,6 (figur 4).
Sammanfattningsvis ger denna metod en noggrann och enkel bedömning av lönsamheten i Drosophila. Hela protokollet tar cirka 14 dagar att slutföra. Förfarandet kräver inte tekniska expertkunskaper. emellertid, rätt timing, en tidsplan för dagliga observationer, och noggrann agar överföring är viktigt för noggrannhet och reproducerbarhet.
Förutom placeringen av druva-agar skiva embryo-sida ner i maten injektionsflaska, en annan avgörande steg i förfarandet är att överföra agar skivan till en mat injektionsflaska senast 48 h efter avlägsnande av druvagar plattan från embryot samling mini burar. Överföring av agar efter 48 h resulterade i embryo och larver förlust, sannolikt på grund av uttorkning av agar skivan. För att räkna L2/L3 övergångar, plattan måste Inkubera för 72 h. Om detta skede är avgörande, bör druvagar plattor hällas tjockare och en fuktig kammare måste användas för att förhindra uttorkning. Korsen sattes upp i embryosamlingsburar som rymmer 35 mm plattor; Detta förfarande kan dock utföras med större embryon uppsamlings burar också, såsom en som rymmer 60 mm eller 100 mm petriskålar. Mat flaskor måste då vara tillräckligt stora för att rymma dessa storlekar.
Det finns åtgärder som kan läggas till i det här protokollet. Som nämnts ovan, L2/L3 övergångar är utmanande att kvantifiera på tallrikar på grund av den tid som krävs och den potentiella uttorkning av agar. Dessutom, larver blir mycket rörlig på ytan av agar, utgör en utmaning att exakt räkna dem. Placera plattorna i kylskåpet i 30 min eller lägga till några droppar av en mild bedövningsmedel (lidokain lösning) på ytan av agar innan du räknar L2/L3 larver kan hjälpa bromsa deras rörelser att räkna dem mer exakt. En varning för dessa modifieringar är att de kan införa variabler (kall känslighet, bedövnings känslighet) och blanda ihop lönsamheten resultat. Även utan dessa steg, genom att använda färgad mat, forskare kan kvantifiera vandrande L3s/prepupae som de bosätta sig på sidan av maten flaskor för att initiera pupation. En begränsning av denna metod är att det kräver att de vuxna som används i korsningar för att överleva är sövda med CO2 för fenotypning att inrätta korsningar i embryon uppsamlings burar. DM ime4 homozygot Mutant hanar inte återhämta sig väl och dö några timmar efter att vakna upp från Co2 behandling. Andra metoder för att immobilisera vuxna för sortering kan utforskas, såsom att placera flaskor i kylskåpet i några minuter och sedan överföra flaskor till krossad is till långsamma rörelser och sortera snabbt och effektivt.
Bortsett från att jämföra alleliska styrkor och deras effekter på lönsamhet, denna metod kan användas för att skärmens känslighet eller resistens mot definierade farmaceutiska föreningar. Till skillnad från andra metoder som skärmen sammansatta toxicitet i cellkulturen15,16,17,18, denna metod använder hela organismer, gör bedömning av utvecklingseffekter lättare att analysera. Sammanfattningsvis, med hjälp av detta protokoll och ändringar däri, kommer att göra det möjligt att mäta alleliska styrkor samt effekterna av miljöfaktorer och kemiska föreningar på Drosophila lönsamhet, fruktsamhet, fertilitet, livslängd, och varaktighet av utvecklingscykeln.
The authors have nothing to disclose.
Vårt arbete finansieras av NIH 1R15GM1131-01 till CFH och NIH PA-12-149 till CFH.
Antimold additive | Carolina | ||
Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
Metal spatula (small) | Carolina | ||
Microwave | Any | To cook grape agar | |
Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |