Denne protokol er designet til at vurdere levedygtigheden af Drosophila i alle udviklingsmæssige stadier, fra embryo til voksen. Metoden kan bruges til at bestemme og sammenligne levedygtigheden af forskellige genotyper eller vækstbetingelser.
I Drosophila melanogasteranvendes rentabilitetsanalyser til at bestemme egnetheden af visse genetiske baggrunde. Alleliske variationer kan resultere i delvis eller fuldstændig tab af levedygtighed på forskellige udviklingsstadier. Vores laboratorium har udviklet en metode til at vurdere levedygtigheden i Drosophila fra embryo til fuldt moden voksen. Metoden er baseret på kvantificering af antallet af afkom, som er til stede på forskellige stadier under udviklingen, begyndende med udklækkede embryoner. Efter at embryonerne er blevet kvantificeret, tælles yderligere stadier, herunder L1/L2, pupae og modne voksne. Når alle stadier er undersøgt, anvendes en statistisk analyse som den Chi-kvadratiske test til at afgøre, om der er en signifikant forskel mellem startantallet af afkom (udklækkede embryoner) og senere stadier, som kulminerede med det observerede antal voksne således afvisning eller accept af nulhypotesen (at antallet af udklækkede embryoner vil være lig med antallet af larver, pupae, og voksne registreres i hele udviklingsfaserne). Den primære fordel ved denne analyse er dens enkelhed og nøjagtighed, da det ikke kræver en embryo skylle til at overføre dem til fødevarer hætteglasset, undgå tab fra tekniske fejl. Selv om den protokol, der er beskrevet her, ikke direkte undersøger L2/L3 larver, kan der tilføjes yderligere trin for at gøre rede for disse. Sammenligning af antallet af udklækkede embryoner, L1, pupae og voksne kan hjælpe med at afgøre, om levedygtigheden blev kompromitteret under L2/L3-faserne for yderligere undersøgelser (brugen af farvet mad hjælper med visuel identifikation af larver). Samlet, denne metode kan hjælpe Drosophila forskere og pædagoger afgøre, hvornår levedygtighed er kompromitteret i løbet af flyve livscyklus. Rutinemæssig vurdering af bestande ved hjælp af denne analyse kan forhindre ophobning af sekundære mutationer, der kan påvirke Fænotypen af den oprindeligt isolerede mutant, især hvis de oprindelige mutationer påvirker fitness. Af denne grund, vores laboratorium vedligeholder flere eksemplarer af hver af vores DM ime4 alleler og rutinemæssigt kontrollerer renhed af hver bestand med denne metode ud over andre molekylære analyser.
Livslang levetid påvirkes af genetiske og ikke-genetiske faktorer. I standard Lab vækstbetingelser ved stuetemperatur, vores laboratorium har observeret betydelig variation af egnethed og levedygtighed blandt forskellige DM ime4 alleler dyrket under identiske betingelser (figur 1 og supplerende tal). Levedygtighed undersøgelser er ofte gjort for at undersøge virkningerne af en bestemt allel kombination eller vækst tilstand i populations genetiske undersøgelser1,2,3,4. Det er imidlertid svært at finde detaljerede analyser af levedygtigheden inden for en ikke-komplementær gruppe af mutationer i den videnskabelige litteratur. En allel er normalt mærket “ikke-væsentlige”, hvis forskeren finder et par individer homozygot for at allel i føde hætteglasset, der huser den afbalancerede bestand5,6. Men, nøjagtige Chi-kvadratiske analyser til at vurdere, om disse homozygoter opstår ved de forventede mendelian nøgletal er ikke rapporteret5,6. Den mest eftergivende temperatur for enhver Drosophila bestand er stuetemperatur (22-23 °c) og, med passende næringsstoffer, livscyklus af vilde-type fluer tager cirka tolv dage til at fuldføre7,8. Da varigheden af hver udviklingsfase af Wild-type Drosophila er kendt7,8, den metode, der er beskrevet i denne rapport kan anvendes til at undersøge, om Drosophila stamme under undersøgelse er egnet på hvert trin sammenlignet med en kontrol, der passer til den genetiske baggrund, som testes. I modsætning til undersøgelser, der fokuserer på et specifikt aspekt af udvikling9, er denne protokol en praktisk måde at vurdere levedygtigheden på forskellige udviklingsstadier.
I vores laboratorium, denne protokol anvendes til at vurdere levedygtigheden af bestande, der er mangelfuld for Drosophila inducer af Meiosis 4 (DM ime4). DM ime4 er et vigtigt gen10 , der koder en RNA-methyltransferase med kritiske roller i RNA-metabolismen i Drosophila og andre flercellede organismer5,6,10, 11 , 12 , 13 , 14 . For hurtigt at evaluere nye alleler af DM ime4 genereret via Crispr/Cas9 (supplerende tal) blev der udført en analyse af slutpunkts levedygtighed, som kun opregnede voksent afkom produceret i hætteglas med afbalancerede bestande (figur 1). Nogle af de anvendte bestande blev beskrevet i de foregående DM ime4 rapporter5,6. Homozygot mutanter opstod på sub-Mendelian niveauer, som bestemt af Chi-kvadratiske analyser (figur 1 og supplerende materialer). For at vurdere, om disse tal, der er lavere end forventet, skyldtes, at der blev lagt færre embryoner, eller færre udklækkede embryoner eller tab af levedygtighed i L1/L2 eller pupae, udvidede vi sporingen til at omfatte tællinger i hvert af disse udviklingsstadier (figur 2, Figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7, figur 8og figur 9).
Her beskriver vi metoden med Wild-type (OreR) fluer. For at empirisk teste denne metode til brug med andre genetiske baggrunde eller Drosophila arter, anbefaler vi at bruge OreR som reference og justere tidspunkter i henhold til den eksperimentelle organisme. Protokollen blev yderligere evalueret for at vurdere levedygtigheden af afkom genereret af krydsning af Jomfru vilde hunner med hanner fra en heterozygot DM ime4 mutant Stock5,6 (figur 4).
Sammenfattende giver denne metode en nøjagtig og enkel vurdering af levedygtigheden i Drosophila. Hele protokollen tager cirka 14 dage at fuldføre. Proceduren kræver ikke ekspert tekniske færdigheder; men korrekt timing, en tidsplan for daglige observationer, og omhyggelig agar overførsel er vigtig for nøjagtighed og reproducerbarhed.
Ud over anbringelse af drue-agar-diskens embryon side ned i hætteglasset med fødevarer er et andet afgørende trin i proceduren at overføre agar-skiven til et fødevare-hætteglas senest 48 h efter fjernelse af drue agarpladen fra embryon opsamlings-mini bure. Overdragelse af agar efter 48 h resulterede i embryo-og larver-tab, sandsynligvis på grund af dehydrering af agar-skiven. For at tælle L2/L3-overgange skal pladen inkubere for 72 h. Hvis dette stadie er afgørende, skal drue agarpladerne hældes tykkere, og der skal anvendes et fugtigt kammer til at forhindre udtørring. Krydsninger blev sat op i embryon opsamlings bure, der rummer 35 mm plader; men denne procedure kan udføres ved hjælp af større embryon samling bure samt, såsom en, der rummer 60 mm eller 100 mm Petri plader. Føde flasker skal så være store nok til at rumme disse størrelser.
Der er trin, der kan føjes til denne protokol. Som nævnt ovenfor er L2/L3-overgange udfordrende at kvantificere på plader på grund af den nødvendige tid og den potentielle dehydrering af agar. Derudover bliver larverne meget mobile på overfladen af agar, hvilket udgør en udfordring til præcist at tælle dem. Anbringelse af pladerne i køleskabet i 30 min eller tilsætning af et par dråber af en mild bedøvelse (lidocain opløsning) på overfladen af agar før optælling L2/L3 larver kan hjælpe med at bremse deres bevægelser til at tælle dem mere præcist. En advarsel til disse ændringer er, at de kan indføre variabler (kold følsomhed, bedøvelses følsomhed) og forvirre levedygtigheden resultater. Selv uden disse trin, ved hjælp af farvet mad, forskerne kan kvantificere vandrende L3s/prepupae som de bosætte sig på siden af fødevarer hætteglas til at indlede pupation. En begrænsning til denne metode er, at det kræver de voksne, der anvendes i Kors til at overleve at blive bedøvet med co2 for fænotypebestemmelse at oprette Kors i embryon indsamling bure. DM ime4 homozygot mutant mænd ikke restituere godt og dø et par timer efter at vågne op fra Co2 behandling. Andre metoder til at immobilisere voksne til sortering kan udforskes, såsom at placere hætteglas i køleskabet i et par minutter og derefter overføre hætteglas til knust is til langsom bevægelse og sortere hurtigt og effektivt.
Ud over at sammenligne de alleliske styrker og deres indvirkning på levedygtigheden kan denne metode anvendes til at screene følsomhed eller resistens over for definerede farmaceutiske forbindelser. I modsætning til andre metoder, der skærm sammensatte toksicitet i cellekultur15,16,17,18, denne metode bruger hele organismer, gør vurdering af udviklingsmæssige virkninger lettere at analysere. I summen, ved hjælp af denne protokol og ændringer deri, vil gøre det muligt at måle alleliske styrker samt virkningerne af miljømæssige faktorer og kemiske forbindelser på Drosophila levedygtighed, frugtbarhed, fertilitet, levetid, og varigheden af udviklingscyklus.
The authors have nothing to disclose.
Vores arbejde er finansieret af NIH 1R15GM1131-01 til CFH og NIH PA-12-149 til CFH.
Antimold additive | Carolina | ||
Beaker | Fisher Scentific | S76100J | Beaker |
Benchmark scientific digital hotplate | The Lab Depot | H3760H | Hot plate |
Britta-filtered tap water to prepare grape agar and instant fly food | Any tap water filtration system | ||
CO2 pistol or FlyNap | Carolina | Anesthetic to sort/count adult flies | |
Dissecting microscope/stereoscope | Amscope | SM-1TSZ-V203 | Dissecting microscope |
Drosophila culture vials and stoppers | Carolina | 173120 | Food vials for growing Drosophila |
Embryo collection mini cage | Genesee Scientific | 59-105 | chamber used to gather embryos |
Erlenmeyer flask | Sigma-Aldrich | 70980 | Erlenmeyer flask |
Formula 4-24 Instant Drosophila Medium, Blue | Carolina | https://www.carolina.com/drosophila-fruit-fly-genetics/formula-4-24-drosophila-medium-blue/FAM_173210.pr | |
Grape agar | Genesee Scientific | 47-102 | Media used for agar plates |
Instant fly flood | Carolina | 173210 | Blue media for food vials |
Large Petri dish or any clear container to be used as a humid chamber by placing wet paper towels to keep the grape-agar plates moist during incubation/pre and post microscopic observation | |||
Metal spatula (small) | Carolina | ||
Microwave | Any | To cook grape agar | |
Petri dish | Kord-Valmark | 2901 | Petri dish for grape agar |
Stir bar | The Lab Depot | 58948-981-EA | Magnetic stir bar |