Inducerende akut lungeskade i mus ved direkte Intratracheal Lipopolysaccharid instillation

Summary

Præsenteret her er en trin-for-trin procedure til at fremkalde akut lungeskade i mus ved direkte intratrakeal lipopolysaccharid instillation og til at udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning væske, og lungevæv. Minimal invasivitet, enkel håndtering, god reproducerbarhed, og titrering af sygdommens sværhedsgrad er fordele ved denne tilgang.

Abstract

Luftvejs administration af lipopolysaccharid (LPS) er en almindelig måde at studere lungebetændelse og akut lungeskade (ALI) i små dyremodeller. Forskellige tilgange er blevet beskrevet, såsom indånding af aerosoliserede LPS samt nasal eller intratrakeale instillation. Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved direkte intratrakeal LPS instillation og udføre FACS analyse af blodprøver, bronchoalveolær skylning (bal) væske, og lungevævet. Efter intraperitoneal sedation er luftrøret eksponeret, og LPS administreres via et 22 G venøs kateter. En robust og reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren induceres inden for timer til dage, afhængigt af den anvendte LPS dosering. Indsamling af blodprøver, BAL-væske, og lunge høst, samt behandling af FACS analyse, er beskrevet i detaljer i protokollen. Selv om brugen af den sterile LPS ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, den beskrevne tilgang tilbyder minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed til at besvare mekanistiske immunologiske spørgsmål. Desuden giver dosistitrering samt brug af alternative LPS præparater eller muse stammer mulighed for graduering af de kliniske virkninger, som kan udvise forskellige grader af ALI sværhedsgrad eller tidligt vs. forsinket indtræden af sygdomssymptomer.

Introduction

Eksperimentelle dyremodeller er uundværlige i grundlæggende immun forskning. Administration af hele bakterier eller mikrobielle komponenter er ofte blevet brugt i små dyremodeller til at inducere lokal eller systemisk inflammation¹. Lipopolysaccharid (LPS eller bakteriel endotoksin) er en cellevægkomponent og et overflade antigen af gramnegative bakterier (f. eks. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. eller legionella spp.). Det termo stabile og store molekyle (molekylvægt 1-4 x 10⁶ kDa) består af en lipid-del (lipid a), kerneregion (oligosaccharid) og et o-polysaccharid (eller o-antigen). Lipid A, med dens hydrofobe fedtsyre kæder, forankrer molekylet i en bakteriel membran og medierer (ved nedbrydning af bakterier) den immunologiske aktivitet og toksicitet af LPS. Efter binding til LPS binding protein (LBP), LPS: LBP komplekser fast CD14/TLR4/MD2 receptor kompleks placeret på overfladen af mange celletyper, inducerer en stærk proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleare translokation og efterfølgende Opregulering af cytokinekspression².

Akut lungeskade (ALI) er defineret som akut hypoksimisk respirationssvigt med bilateralt lungeødem i fravær af hjerteinsufficiens³. Luftvejs administration af LPS er en almindelig måde at fremkalde pulmonal inflammation og Ali^4,5,6,7. Selv om det sterile stof ikke er egnet til at studere farmakologiske interventioner i smitsomme sygdomme, kan mekanistiske immunologiske spørgsmål besvares med tilstrækkelig præcision. Instillation af LPS i luftrøret inducerer en robust inflammatorisk reaktion med leukocyt invasion, upregulering af proinflammatoriske cytokiner, og afbrydelse af alveolo-kapillar barrieren inden for timer til dage, afhængigt af LPS dosering^{3, 6,7}.

Den præsenterede protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin procedure til at inducere Ali i mus ved intratrakeal LPS instillation. Modellen er blevet valideret ved at vurdere cytokin-ekspression, neutrofile granulocyt-invasion og intra-alveolær albumin lækage som tidligere beskrevet⁸.

Protocol

Denne dyre protokol blev godkendt af den lokale Komité for dyrepasning (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokol nr. 84-02.04.2015) og blev udført i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer for brug af levende dyr (NIH offentliggørelse Nr. 85-23, revideret 1996). 1. ALI induktion Brug voksne C57BL/6-mus i en alder af ca. 10-12 uger. Hus dyrene i individuelt ventilerede bure med fri adgang til vand og standard gnaver Chow. Men det er muligt at udføre …

Representative Results

Den beskrevne tilgang til at inducere ALI i mus blev valideret ved at vurdere cytokinekspression, neutrofile granulocyt infiltration og alveolo-kapillar barriere forstyrrelse 24 h og 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerede dyr tjente som kontrol. Intratracheal LPS administration inducerede en robust pulmonal proinflammatorisk respons. Ekspression af TNF-α i lungevæv var signifikant upreguleret og nåede en vedvarende og mere end 50 gange større sammenlignet med kontroldyr [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 11,6); …

Discussion

Minimal invasivitet, enkel håndtering, og god reproducerbarhed er centrale elementer i den præsenterede tilgang til at inducere ALI i en lille gnaver model. Brugen af LPS i stedet for hele bakterier i dyremodeller har fordele. Det er en stabil og ren sammensatte og kan opbevares i lyofiliseret form indtil brug. Det er en potent stimulerende for medfødte immunrespons via TLR4 pathway, og dens biologiske aktivitet kan let kvantificeres, lette titrering af sygdommens sværhedsgrad med god reproducerbarhed. Desuden, bruge…

Materials

1 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300013
10 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	309110
Anti-CD115 (c-fms) APC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) – FITC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) – eF450	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7	Bio Legend, San Diego, CA	127623
Buprenorphine hydrochloride	Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old	Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	340487
Canula 23 gauge 1''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300800
Canula 26 gauge 1/2''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	303800
Cell strainer 70 µm	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	352350
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	1148089
Deoxyribonuclease II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8764
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E7889
FACS tubes, 5 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	551579
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F2442
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11049-10
Isoflurane	Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	553141
Red blood cell lysis buffer	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	14060-09
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S2002
Spring scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15018-10
Tissue forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11021-12
Tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	30125150
Venous catheter, 22 gauge	B.Braun, Melsungen, Germany	4268091B
Xylazine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany