Inducera akut lung skada hos möss genom direkt Intratracheal Lipopolysaccharide instillation

Summary

Presenteras här är en steg-för-steg förfarande för att framkalla akut lung skada hos möss genom direkt intratrakeal lipopolysackarid instillation och att utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolära sköljning vätska, och lung vävnad. Minimal invasivitet, enkel hantering, god reproducerbarhet och titrering av sjukdomens svårighets grad är fördelar med denna metod.

Abstract

Luftvägs administrering av lipopolysackarid (LPs) är ett vanligt sätt att studera pulmonell inflammation och akut lung skada (Ali) i små djur modeller. Olika metoder har beskrivits, såsom inandning av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal instillation. Det presenterade protokollet beskriver ett detaljerat steg-för-steg-förfarande för att inducera Ali hos möss genom direkt intratrakeal LPS instillation och utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolar sköljning (bal) vätska, och lung vävnad. Efter intraperitoneal sedering exponeras luft strupen och LPS administreras via en 22 G ven kateter. En robust och reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären induceras inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering används. Insamling av blod prov, BAL vätska, och lung skörd, samt bearbetning för FACS analys, beskrivs i detalj i protokollet. Även om användningen av sterila LPS inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, erbjuder den beskrivna metoden minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet för att besvara mekanistiska immunologiska frågor. Dessutom, dostitrering samt användning av alternativa LPS preparat eller mus stammar tillåta modulering av de kliniska effekterna, som kan uppvisa olika grader av ALI svårighets grad eller tidigt vs. sen debut av sjukdoms symtomen.

Introduction

Experimentella djur modeller är oumbärliga i grundläggande immun forskning. Administrering av hela bakterier eller mikrobiella komponenter har ofta använts i små djur modeller för att framkalla lokal eller systemisk inflammation¹. Lipopolysaccharide (LPS, eller bakteriell endotoxin) är en cell vägg komponent och ytantigen av Gramnegativa bakterier (t. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Termostabila och stora molekylen (molekyl vikt 1-4 x 10⁶ kDa) består av en Lipiddel (lipid a), kärn region (oligosackarid) och en o-polysackarider (eller o-antigen). Lipid A, med sina hydrofoba fett syror kedjor, förankrar molekylen i ett bakterie membran och förmedlar (vid nedbrytning av bakterier) den immunologiska aktiviteten och toxiciteten hos LPS. Efter bindning till LPS bindande protein (LBP), LPS: LBP komplex ligera CD14/TLR4/MD2 receptor komplex ligger på ytan av många cell typer, inducera en stark proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleär translokationen och efterföljande uppreglering av cytokin uttryck².

Akut lung skada (ALI) definieras som akut hypoxemisk respiratorisk svikt med bilateralt lungödem i avsaknad av hjärt svikt³. Luftvägs administrering av LPS är ett vanligt sätt att inducera pulmonell inflammation och Ali^4,5,6,7. Även om det sterila ämnet inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, kan mekanistiska immunologiska frågor besvaras med tillräcklig precision. Instillation av LPS i luft strupen inducerar en robust inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering^{3, 6,7}.

Det presenterade protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-procedur för att inducera Ali hos möss genom intratrakeal LPS instillation. Modellen har validerats genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt invasion, och intra-alveolära albuminläckage som tidigare beskrivits⁸.

Protocol

Detta djur protokoll godkändes av den lokala kommittén för djur vård (LANUV, Recklinghausen, Tyskland; protokoll nr 84-02.04.2015) och utfördes i enlighet med de nationella hälso instituten rikt linjer för användning av levande djur (NIH-publikation Nr 85-23, reviderad 1996). 1. ALI-induktion Använd vuxen C57BL/6 möss i åldrarna ca 10-12 veckor. Hus djuren i individuellt ventilerade burar med fri till gång till vatten och standard gnagare Chow. Det är dock möjligt att u…

Representative Results

Den beskrivna metoden för att inducera ALI hos möss validerades genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt infiltration, och alveolo-kapillär barriär störningar 24 h och 72 h efter LPS instillation. PBS-injicerade djur fungerade som kontroll. Intratracheal LPS administrering inducerade en robust pulmonell proinflammatorisk respons. Uttryck för TNF-α i lung vävnad var signifikant uppreglerad, uppnådde en ihållande och mer än 50-faldig ökning jämfört med kontroll djuren [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 5…

Discussion

Minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet är viktiga inslag i den presenterade metoden för att inducera ALI i en liten gnagare modell. Användning av LPS i stället för hela bakterier i djur modeller har fördelar. Det är en stabil och ren förening och kan lagras i frystorkad form fram till användning. Det är en potent stimulerande för medfödda immun svar via TLR4 vägen, och dess biologiska aktivitet kan lätt kvantifieras, under lätta titrering av sjukdomens svårighets grad med god reprod…

Materials

1 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300013
10 ml syringes	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	309110
Anti-CD115 (c-fms) APC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	17-1152-80
Anti-CD11b (M1/70) – FITC	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	11-0112-81
Anti-CD45 (30-F11) – eF450	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	48-0451-82
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	25-4801-82
Anti-Gr1 (RB6-8C5)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	552093
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	45-5932-82
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7	Bio Legend, San Diego, CA	127623
Buprenorphine hydrochloride	Indivior UK Limited, Berkshire, UK
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old	Charles River, Wilmongton, MA, USA
CaliBRITE APC-beads (6µm)	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	340487
Canula 23 gauge 1''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	300800
Canula 26 gauge 1/2''	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	303800
Cell strainer 70 µm	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA	352350
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	1148089
Deoxyribonuclease II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8764
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8662
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8537
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	E7889
FACS tubes, 5 ml	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	551579
Fetal calf serum (FCS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F2442
Forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11049-10
Isoflurane	Baxter, Unterschleißheim, Germany
Ketamine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	L2630
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	L23101
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2	BD, Franklin Lakes, NJ, USA	553141
Red blood cell lysis buffer	Thermo Fisher, Waltham, MA, USA	00-4333-57
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	14060-09
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	S2002
Spring scissors	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	15018-10
Tissue forceps	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany	11021-12
Tubes	Eppendorf, Hamburg, Germany	30125150
Venous catheter, 22 gauge	B.Braun, Melsungen, Germany	4268091B
Xylazine hydrochloride	Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany