Presenteras här är en steg-för-steg förfarande för att framkalla akut lung skada hos möss genom direkt intratrakeal lipopolysackarid instillation och att utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolära sköljning vätska, och lung vävnad. Minimal invasivitet, enkel hantering, god reproducerbarhet och titrering av sjukdomens svårighets grad är fördelar med denna metod.
Luftvägs administrering av lipopolysackarid (LPs) är ett vanligt sätt att studera pulmonell inflammation och akut lung skada (Ali) i små djur modeller. Olika metoder har beskrivits, såsom inandning av aerosolized LPS samt nasal eller intratrakeal instillation. Det presenterade protokollet beskriver ett detaljerat steg-för-steg-förfarande för att inducera Ali hos möss genom direkt intratrakeal LPS instillation och utföra FACS analys av blodprover, bronkoalveolar sköljning (bal) vätska, och lung vävnad. Efter intraperitoneal sedering exponeras luft strupen och LPS administreras via en 22 G ven kateter. En robust och reproducerbar inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären induceras inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering används. Insamling av blod prov, BAL vätska, och lung skörd, samt bearbetning för FACS analys, beskrivs i detalj i protokollet. Även om användningen av sterila LPS inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, erbjuder den beskrivna metoden minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet för att besvara mekanistiska immunologiska frågor. Dessutom, dostitrering samt användning av alternativa LPS preparat eller mus stammar tillåta modulering av de kliniska effekterna, som kan uppvisa olika grader av ALI svårighets grad eller tidigt vs. sen debut av sjukdoms symtomen.
Experimentella djur modeller är oumbärliga i grundläggande immun forskning. Administrering av hela bakterier eller mikrobiella komponenter har ofta använts i små djur modeller för att framkalla lokal eller systemisk inflammation1. Lipopolysaccharide (LPS, eller bakteriell endotoxin) är en cell vägg komponent och ytantigen av Gramnegativa bakterier (t. ex. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., eller Legionella spp.). Termostabila och stora molekylen (molekyl vikt 1-4 x 106 kDa) består av en Lipiddel (lipid a), kärn region (oligosackarid) och en o-polysackarider (eller o-antigen). Lipid A, med sina hydrofoba fett syror kedjor, förankrar molekylen i ett bakterie membran och förmedlar (vid nedbrytning av bakterier) den immunologiska aktiviteten och toxiciteten hos LPS. Efter bindning till LPS bindande protein (LBP), LPS: LBP komplex ligera CD14/TLR4/MD2 receptor komplex ligger på ytan av många cell typer, inducera en stark proinflammatorisk reaktion med NF-κb nukleär translokationen och efterföljande uppreglering av cytokin uttryck2.
Akut lung skada (ALI) definieras som akut hypoxemisk respiratorisk svikt med bilateralt lungödem i avsaknad av hjärt svikt3. Luftvägs administrering av LPS är ett vanligt sätt att inducera pulmonell inflammation och Ali4,5,6,7. Även om det sterila ämnet inte lämpar sig för att studera farmakologiska interventioner vid infektions sjukdomar, kan mekanistiska immunologiska frågor besvaras med tillräcklig precision. Instillation av LPS i luft strupen inducerar en robust inflammatorisk reaktion med leukocytinvasion, uppreglering av proinflammatoriska cytokiner, och störningar av alveolo-kapillär barriären inom några timmar till dagar, beroende på LPS dosering3, 6,7.
Det presenterade protokollet beskriver en detaljerad steg-för-steg-procedur för att inducera Ali hos möss genom intratrakeal LPS instillation. Modellen har validerats genom att bedöma cytokin uttryck, neutrofila granulocyt invasion, och intra-alveolära albuminläckage som tidigare beskrivits8.
Minimal invasivitet, enkel hantering och god reproducerbarhet är viktiga inslag i den presenterade metoden för att inducera ALI i en liten gnagare modell. Användning av LPS i stället för hela bakterier i djur modeller har fördelar. Det är en stabil och ren förening och kan lagras i frystorkad form fram till användning. Det är en potent stimulerande för medfödda immun svar via TLR4 vägen, och dess biologiska aktivitet kan lätt kvantifieras, under lätta titrering av sjukdomens svårighets grad med god reprod…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Jan Kleiner och Susanne Schulz för att ha tillhandahållit teknisk support. Författarna erkänner det utmärkta stöd av flödet cytometri kärnan anläggningen vid den medicinska fakulteten vid Bonns universitet. Författarna erhöll ingen finansiering från någon extern organisation. En del av de uppgifter som lämnats i resultat sektionen och som skildras i figur 3 har redan visats i en tidigare publikation8.
1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |