É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.
A administração das vias aéreas de lipopolissacárido (LPS) é uma maneira comum de estudar a inflamação pulmonar e a lesão pulmonar aguda (ALI) em modelos animais pequenos. Várias aproximações foram descritas, tais como a inalação de LPs aerosolized assim como a instilação nasal ou intratraqueal. O protocolo apresentado descreve um procedimento passo a passo detalhado para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal direta dos LPs e executa a análise de FACS das amostras de sangue, do líquido broncoalveolar do lavagem (BAL), e do tecido do pulmão. Após sedação intraperitoneal, a traquéia é exposta e a LPS é administrada através de cateter venoso de 22 G. Uma reação inflamatória robusta e reprodutível com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias, e ruptura da barreira alveolo-capilar é induzida dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS usada. A coleta de amostras de sangue, o fluido de LBA e a colheita pulmonar, bem como o processamento para a análise de FACS, são descritos detalhadamente no protocolo. Embora o uso do LPS estéril não seja adequado para estudar intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, a abordagem descrita oferece uma invasividade mínima, manuseio simples e boa reprodutibilidade para responder a questões imunológicas mecanísticas. Além disso, a titulação da dose assim como o uso de preparações alternativas do LPS ou de tensões do rato permitem a modulação dos efeitos clínicos, que podem apresentar graus diferentes de severidade de ALI ou início contra o início atrasado de sintomas da doença.
Modelos experimentais de animais são indispensáveis na pesquisa imunológica básica. A administração de bactérias inteiras ou componentes microbianos tem sido freqüentemente usada em pequenos modelos animais para induzir inflamação local ou sistêmica1. Lipopolissacarídeo (LPS, ou endotoxina bacteriana) é um componente da parede celular e antígeno de superfície de bactérias Gram-negativas (por exemplo, Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., ou Legionella spp.). A molécula termotérmica e grande (peso molecular 1-4 x 106 kDa) consiste em uma fração lipídica (lipídios a), região central (oligossacarídeos), e um polissacarídeos o (ou o antígeno). O lipídio a, com suas correntes de ácidos graxos hidrofóbicos, Ancora a molécula em uma membrana bacteriana e Medeia (após a degradação das bactérias) a atividade imunológica e a toxicidade dos LPs. Após ligação à proteína de ligação LPS (LBP), os complexos LPS: LBP ligam o complexo receptor CD14/TLR4/MD2 localizado na superfície de muitos tipos de células, induzindo uma forte reação pró-inflamatória com translocação nuclear de NF-κB e subsequente upregulação da expressão de citocina2.
A lesão pulmonar aguda (ALI) é definida como insuficiência respiratória hipoxêmica aguda com edema pulmonar bilateral na ausência de insuficiência cardíaca3. A administração das vias aéreas de LPs é uma forma comum de induzir inflamação pulmonar e ali4,5,6,7. Embora a substância estéril não seja adequada para o estudo de intervenções farmacológicas em doenças infecciosas, as questões imunológicas mecanísticas podem ser respondidas com precisão adequada. A instilação de LPS na traquéia induz uma reação inflamatória robusta com invasão leucocitária, upregulação de citocinas pró-inflamatórias e ruptura da barreira alveolócapilar dentro de horas a dias, dependendo da dosagem de LPS3, 6,7.
O protocolo apresentado descreve um procedimento detalhado da etapa-por-etapa para induzir o ali nos ratos pela instilação intratraqueal dos LPs. O modelo foi validado avaliando-se a expressão de citocinas, invasão de granulócitos neutrofínicos e vazamento de albumina intralalveolar, conforme descrito anteriormente8.
A invasividade mínima, a manipulação simples e a boa reprodutibilidade são características-chave da abordagem apresentada para induzir a ALI em um pequeno modelo de roedores. O uso de LPS em vez de bactérias inteiras em modelos animais tem vantagens. É um composto estável e puro e pode ser armazenado em forma liofilizada até o uso. É um potente estimulante para respostas imunes inatas através da via TLR4, e sua atividade biológica pode ser prontamente quantificada, facilitando a titulação da severidade da d…
The authors have nothing to disclose.
Os autores desejam agradecer a Jan Kleiner e Susanne Schulz por prestarem apoio técnico. Os autores reconhecem o apoio excelente da facilidade do núcleo da citometria do fluxo na faculdade médica da Universidade de Bona. Os autores não receberam nenhum financiamento de qualquer organização externa. Uma parte dos dados fornecidos na seção de resultados e descrita na Figura 3 já foi mostrada em uma publicação anterior8.
1 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300013 | |
10 ml syringes | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 309110 | |
Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 17-1152-80 | |
Anti-CD11b (M1/70) – FITC | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 11-0112-81 | |
Anti-CD45 (30-F11) – eF450 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 48-0451-82 | |
Anti-F4/80 (BM-8) – PE Cy7 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 25-4801-82 | |
Anti-Gr1 (RB6-8C5) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 552093 | |
Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 45-5932-82 | |
Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7 | Bio Legend, San Diego, CA | 127623 | |
Buprenorphine hydrochloride | Indivior UK Limited, Berkshire, UK | ||
C57BL/6 mice, female, 10 – 12 weeks old | Charles River, Wilmongton, MA, USA | ||
CaliBRITE APC-beads (6µm) | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 340487 | |
Canula 23 gauge 1'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 300800 | |
Canula 26 gauge 1/2'' | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 303800 | |
Cell strainer 70 µm | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 352350 | |
Collagenase Type I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 1148089 | |
Deoxyribonuclease II | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8764 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8662 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), without calcium chloride and magnesium chloride, sterile | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D8537 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | E7889 | |
FACS tubes, 5 ml | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 551579 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | F2442 | |
Forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11049-10 | |
Isoflurane | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
Ketamine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany | ||
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | L2630 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | L23101 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™), Clone 2.4G2 | BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 553141 | |
Red blood cell lysis buffer | Thermo Fisher, Waltham, MA, USA | 00-4333-57 | |
RPMI-1640, with L-glutamine and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | R8758 | |
Scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 14060-09 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | S2002 | |
Spring scissors | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 15018-10 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | 11021-12 | |
Tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30125150 | |
Venous catheter, 22 gauge | B.Braun, Melsungen, Germany | 4268091B | |
Xylazine hydrochloride | Serumwerk Bernburg, Bernburg, Germany |