Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Resumo

Descrevemos um método para a caracterização de transportadores de membrana sufrágio movidos a prótons em preparações de vesículas de membrana produzidas pela expressão heterologous em E. coli e lise de células usando uma imprensa francesa.

Resumo

Vários métodos foram desenvolvidos para caracterizar funcionalmente novos transportadores de membrana. Poliaminas são onipresentes em todos os organismos, mas trocadores de poliamina em plantas não foram identificados. Aqui, descrevemos um método para caracterizar anticarregadores de poliamina usando vesículas de membrana geradaa a partir da lise das células escherichia coli expressando heterologously um antiporter vegetal. Primeiro, nós heterologously expressou AtBAT1 em uma cepa E. coli deficiente em poliamina e transportadores de câmbio arginina. Vesículas foram produzidas usando uma imprensa francesa, purificada pela ultracentrífugae e utilizadas em um ensaio de filtragem de membrana de substratos rotulados para demonstrar a especificidade do substrato do transportador. Estes ensaios demonstraram que atbat1 é um transportador proton-mediado de arginina, γ-aminobutírico ácido (GABA), putrescine e espermidina. A cepa mutante que foi desenvolvida para o ensaio do AtBAT1 pode ser útil para a análise funcional de outras famílias de trocadores de poliamina vegetal e animal. Nós também supor que esta abordagem pode ser usada para caracterizar muitos outros tipos de antiporters, desde que essas proteínas podem ser expressas na membrana celular bacteriana. E. coli é um bom sistema para a caracterização de novos transportadores, uma vez que existem vários métodos que podem ser empregados para mutgenizar os transportadores nativos.

Introdução

As proteínas envolvidas no tráfico de metabólitos constituem um nível essencial de regulação fisiológica, mas a grande maioria dos transportadores de membranas vegetais ainda não foi funcionalmente caracterizada. Várias estratégias foram implementadas para caracterizar novas proteínas de transporte. Expressão heterologous em organismos modelo como E. coli e células eucarióticas, como levedura, oócitos xenopus, células de mamíferos, células de insetos e células vegetais têm sido usados para determinar sua atividade de transporte¹. As células eucarióticas são favorecidas pela expressão de proteínas eucarióticas, pois a composiçã....

Protocolo

1. Geração do E. coli Double Knock Out Mutant com Transdução P1

1. Obter o E. coli single-knockout mutantes cepas ΔPotE e ΔCadB do E. coli Genetic Stock Center(http://cgsc.biology.yale.edu).
   Nota: A cepa ΔPotE é resistente à kanamicina²⁶ e a cepa ΔCadB é resistente à tetraciclina^27.
2. Construa a cepa de nocaute duplo PotE/CadB (DKO) usando o protocolo de transdução P1^28.
   1. Preparação de lysate
      1. Diluir uma cultura durante ....

Resultados

Os principais passos neste protocolo são resumidos pictoally na Figura 1. Resumidamente, as células De E. coli deficientes em todos os trocadores de poliamina e expressando AtBAT1 são cultivadas, centrífugas, lavadas com um tampão e submetidas a lise celular usando uma imprensa francesa. Lise tende a produzir vesículas que são na sua maioria de dentro para fora e prender o tampão fora das células. Os detritos celulares são removidos por cent.......

Discussão

No presente estudo, descrevemos um método para a caracterização de um antiporter, primeiro expressando a proteína em E. coli e, em seguida, gerando vesículas de membrana, de modo que a proteína expressa heterologously pode ser amenizado em um sistema livre de células. Além de equipamentos encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular, esta estratégia requer o uso de uma imprensa francesa, uma ultracentrífuga e acesso a uma instalação para realizar ensaios de radioisótopos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescina	PerkinElmer	NET185001MC
3H-espermidina	PerkinElmer	NET522001MC
4-cloro-1-naftol	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginina	Moravek Inc.	MC137
Arginina	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-termo)-HRP anticorpo	ThermoFisher	R931-25	Detecta a etiqueta de poli-histidina C-terminal (6xHis), requer o grupo carboxila livre para detecção
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Kit de ensaio de proteína BCA	ThermoFisher	23227	Pierce BCA asay kit.
Azul de bromofenol	Bio-Rad	161-0404
Carboxipeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrífuga	Sorvall		SS-34 rotor de ângulo fixo e rotor de ângulo fixo GA-6
Moedor de tecidos	Dounce LabGenome	7777-7	Homogeneizador de pirex Corning 7777-7 com bico de vazamento.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	coquetel de cintilação
EDTA	Sigma-Aldrich
Coletor de filtração	Hoefer	FH225V
Célula de pressão francesa	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamato	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Peróxido de hidrogênio	KROGER
Cloreto de Potássio	J.T. Baker	3040-01
Contador de cintilação líquida	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
	Merck Millipore	hawp02500	0.45 µ Kit
de limpeza de PCR	M Genscript		QuickClean II
Fosfato de potássio dibásico	ThermoFisher	P290-500
putrescina	fluka	32810
Fosfato de potássio monobásico	J.T.Baker	4008
Espermidina	Sigma-aldrich	S2501
Cepas: E. coli Δ potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10	Este manuscrito	está disponível mediante solicitação.	A deformação é deficiente nos trocadores de poliamina PotE e CadB.
Produtos de pesquisa	Tris-base	T60040-1000
Ultracentrífuga	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT rotor de ângulo fixo
Tubos de ultracentrífuga	ThermoFisher	45237	Tubos de centrífuga para rotor S150-AT
Vetor: pBAD-DEST49 Vetor de	ThermoFisher		Gateway para E. coli

Filtros de membrana de nitrocelulose expressão