Hier präsentieren wir eine zuverlässige, minimalinvasive und kostengünstige Methode zur Aufzeichnung und Interpretation von Elektrokardiogrammen in lebenden anästhesisierten erwachsenen Zebrafischen.
Die Elektrokardiogramm-Wellenformen von erwachsenen Zebrafischen und denen des Menschen sind bemerkenswert ähnlich. Diese Elektrokardiogrammähnlichkeiten erhöhen den Wert von Zebrafischen nicht nur als Forschungsmodell für die menschliche Herzelektrophysiologie und Myopathien, sondern auch als Ersatzmodell im Arzneimittel-Screening mit hohem Durchsatz für potenzielle Kardiotoxizitäten Menschen, wie z. B. QT-Verlängerung. Daher ist die In-vivo-Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische ein elektrisches Phänotypisierungswerkzeug, das für querschnitts- oder Längs-in-vivo-Elektrophysiologische Charakterisierungen notwendig, wenn nicht gar unverzichtbar ist. Zu oft stellt jedoch das Fehlen einer zuverlässigen, praktischen und kostengünstigen Aufzeichnungsmethode nach wie vor eine große Herausforderung dar, die verhindert, dass dieses In-vivo-Diagnoseinstrument leichter zugänglich wird. Hier beschreiben wir einen praktischen, unkomplizierten Ansatz zur In-vivo-Elektrokardiographie für erwachsene Zebrafische mit einem wartungsarmen, kostengünstigen und umfassenden System, das konsistente, zuverlässige Aufnahmen liefert. Wir veranschaulichen unser Protokoll mit gesunden erwachsenen männlichen Zebrafischen im Alter von 12-18 Monaten. Wir führen auch eine schnelle Echtzeit-Interpretationsstrategie für die Qualitätsvalidierung ein, um Datengenauigkeit und Robustheit früh im Prozess der Elektrokardiogrammaufzeichnung sicherzustellen.
Das Zebrafisch (Danio rerio) Herz befindet sich anteroventral an der Brusthöhle zwischen dem Operculum und den Brustgürteln. Das Herz ist ziemlich locker in einem silberfarbenen Perikardsack eingeschlossen. Anatomisch unterscheidet sich das Zebrafischherz von den vierkammerigen menschlichen und anderen Säugetierherzen aufgrund seiner geringen Skala (100-fach kleiner als das menschliche Herz) und seiner zweikammerigen Struktur, die nur aus einem Atrium und einem Ventrikel besteht. Nichtsdestotrotz sind die Elektrokardiogramm-Wellenformen (EKG) und die Dauer des QT-Intervalls beider Arten bemerkenswert ähnlich (Abbildung 1). Dementsprechend hat sich Zebrafisch als ein beliebtes Modell für die Untersuchung von menschlichen vererbten Arrhythmien1,2,3 und für High-Throughput-Medikamente Screening von potenziellen menschlichen Kardiotoxikitäten4,5 , wie z. B. QT-Verlängerung.
Bei der routinemäßigen Beurteilung menschlicher Herzerkrankungen ist das Körper-Oberflächen-EKG seit seiner Erfindung durch Einthoven 1903 das am weitesten verbreitete nichtinvasive Diagnoseinstrument der ersten Linie geworden. Im Gegensatz dazu ist diese Technik seit der ersten Anpassung der Körper-Oberflächen-EKG-Aufzeichnungsmethode für erwachsene Zebrafische im Jahr 20066 und mehreren Modifikationen danach7für viele Forscher auf diesem Gebiet weitgehend unzugänglich geblieben. die Popularität dieses Tiermodells. Bei anderen Forschern, die In-vivo-EKG-Verhöre für erwachsene Zebrafische durchführten, führten große Unterschiede zwischen den Bedienern zu Inkonsistenzen in EKG-Befunden aus verschiedenen Studien. Häufige Gründe sind umständliche und teure spezialspezifische Geräte und Software, ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und Verwirrung in Bezug auf die Platzierung der Elektroden, die alle durch ein unvollständiges Verständnis der eKG-Funktionen für erwachsene Zebrafische und zugrunde liegenden Gewebemechanismen. Da in vivo EKG das einzige diagnostische Werkzeug für lebende Zebrafische ist, besteht ein klarer Bedarf an einer standardisierten Methode zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Spezifität, Reproduzierbarkeit und Zugänglichkeit.
Hier stellen wir einen praktischen, zuverlässigen und validierten Ansatz zur Aufzeichnung und Interpretation von Zebrafischen in vivo Elektrokardiogrammen vor (Abbildung 2). Mit einem einzigen bipolaren Blei in der Frontalebene untersuchten wir die Veränderungen der EKG-Wellenformen und Intervalldauern von lebenden anästhesisierten gesunden Wildtyp AB erwachsenen Zebrafischen.
Bei der Erfassung von in vivo EKG für erwachsene Zebrafische mit einem einzigen Blei, wie wir in dieser Studie gezeigt haben, gibt es eine Reihe von Vorbehalten hinsichtlich der Qualität und Gültigkeit der EKG-Aufzeichnungsergebnisse. Erstens, bei der Auswahl der geeigneten Anästhetika und die Bestimmung der minimal benötigten Anästhesie Konzentration, Tiefe, und Dauer, balancieren die Anästhesie Kardiotoxikitäten gegen die kritische Notwendigkeit, Bewegungsartefakte zu unterdrücken und die a priori Bestimmung für ein Überleben vs. terminales experimentelles Design. Nutzung der synergistischen Potenz einer Kombination von Multiplen Anästhetikaaus verschiedenen Wirkstoffklassen 5,14 und Paralytika1,6 zur Senkung der Dosis einzelner Wirkstoffe5 oder eine niedrige Erhaltungsdosis nach einer höheren Induktionsdosis sind typische Strategien. Trotz seiner bekannten potentiellen kardiorespiratorischen Toxizitäten, einschließlich Tod8,ist Tricain immer noch das am weitesten verbreitete, das beste verfügbare und das einzige Anästhetikum, das von der US Food and Drug Administration (FDA) für Zebrafische zugelassen wurde. Anästhesie. Tricain wurde im Volksmund in der EKG-Aufnahme von erwachsenen Zebrafischen entweder als Einzelmittel oder in Kombination mit anderen Anästhetika oder Paralytika verwendet.
Zweitens kann die Bleiplatzierungsgenauigkeit zumindest für gesunde normale Zebrafische mit unseren vier Validierungskriterien für ein normales erwachsenes Zebrafisch-EKG gewährleistet werden. Von den vier Validierungskriterien, die wir hier vorschlagen, bestätigen die letzten beiden Kriterien zusammen die grundlegende Übereinstimmung zwischen der Polarität der R-Welle und der Der T-Welle in einem normalen EKG5,7,15. Diese R- und T-Wellenkonkordanz ist eine zufällige, aber kritische Ähnlichkeit zwischen Zebrafisch und menschlichem16,17 normalem EKG, die zur klinischen Relevanz des Zebrafischherzmodells als Ersatz für menschliches Herz beiträgt. Elektrophysiologie. Mehrere gutartige oder bösartige Bedingungen können jedoch eines der vier Validierungskriterien ungültig machen. Zum Beispiel geht die R- und T-Wellenkonkordanz in myokardialer Ischämie7,15verloren. Dieser Verlust der R- und T-Wellenkonkordanz in der Myokard-Ischämie ist eine weitere frappierende Ähnlichkeit zwischen Zebrafisch und menschlichem EKG, die zur klinischen Relevanz des Myokardinfarktmodells des Zebrafischs beiträgt.
Schließlich empfehlen wir eine Standardpraxis in der EKG-Analyse. Mit dem Aufkommen der Technologie kann die EKG-Analysesoftware eine automatische EKG-Interpretation generieren. Wir empfehlen jedoch dringend, dass geschulte Menschen immer alle EKGs auf der Grundlage des jeweiligen klinischen Szenarios, das zur EKG-Aufzeichnung führt, neu interpretieren und überprüfen sollten. Eine routinemäßige übermäßige Abhängigkeit ausschließlich auf die automatische Interpretation durch eine EKG-Analysesoftware ist nicht ratsam, insbesondere in Gegenwart gängiger normaler EKG-Varianten, Herzpathologien oder suboptimaler Bleiplatzierung.
Diese Studie konzentriert sich auf die minimalinvasive Methode für kurze EKG-Aufnahmesitzungen. Sollte jedoch eine stundenlange, verlängerte EKG-Aufnahmesitzung erforderlich sein, sind Änderungen erforderlich, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung, Hydratation und Anästhesie durch kontinuierliche Durchblutung zu gewährleisten6.
Erhöhen Sie außerdem das Signal-Rausch-Verhältnis um mindestens drei Möglichkeiten. Die Wahl eines leistungsstärkeren Verstärkers ist oft eine kostspielige, wenn nicht gar unpraktische Option. Das Öffnen des Perikardsacks zur Reduzierung des Volumenleiters ist ein vernünftiger, wenn auch invasiver Ansatz, der angenommen wurde7. Strategische Bleiplatzierung, um die Bleiachse in einer Richtung parallel zur Hauptherzachse auszurichten (Abbildung 4B) wird die EKG-Spannungssignale maximieren, kann aber Versuch und Fehler erfordern, insbesondere in Abwesenheit einer Perikardiotomie.
Die hier vorgestellte In-vivo-EKG-Abfragemethode für erwachsene Zebrafische bietet vier Hauptvorteile. Erstens erfordert unser minimalinvasiver Ansatz nur elektrodeneinschubs, aber keine Entfernung von Fischen oder Thorakotomie-Perikardiotomie. Daher ermöglicht unser Ansatz durch die Minimierung der Schmerzen für die Fische wiederholte EKG-Verhöre in Längs-Überlebensstudien. Zweitens: Wenn Anästhetika die Fischbewegung angemessen unterdrücken, ergibt das in vivo EKG-Aufzeichnungssystem in unserer Studie konsequent ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis mit geräuschfreien Rohsignalen. Drittens stellt die hier vorgeschlagene Qualitätsvalidierung mit vier Kriterien datengenauigkeit und Robustheit zu einem frühen Zeitpunkt der EKG-Datenerfassung sicher und minimiert bedienerabhängige Schwankungen. Schließlich kapselt insbesondere unser letztes Validierungskriterium (die normale T-Welle ist aufrecht) die Übereinstimmung der R-Welle und der T-Welle, ein wichtiges menschenähnliches Merkmal des Zebrafisch-Normal-EKG (Abbildung 1).
Es gibt jedoch noch vier wesentliche Einschränkungen der aktuellen In-vivo-EKG-Methodik für erwachsene Zebrafische durch unsere Gruppe und andere.
Erstens erfordert die mangelnde zusammenarbeit der Themen die Notwendigkeit einer Anästhesie mit ihren begrenzten Folgen für die kardiorespiratorische Toxizität. Für in vivo EKG-Verhör, während menschliche Patienten nie Sedierung benötigen, Zebrafische immer Anästhetika oder Paralytika benötigen, die alle variable kardiorespiratorische Toxizitäten verursachen.
Zweitens erhöht die Notwendigkeit, das angeschlossene EKG zu sichern, die Invasivität eines ansonsten nicht-invasiven Verfahrens leicht. Während die Bleiplatzierung in der Körper-Oberflächen-EKG-Aufzeichnung von Menschen völlig nicht-invasiv ist, da Elektroden an der menschlichen Epidermis haften, ist die Bleiplatzierung für die In-vivo-EKG-Aufzeichnung von Zebrafischen invasiver, da Stahlelektroden zumindest Stahlelektroden die Fischhaut für ein sicheres Einführen in die Fischmuskulatur punktieren.
Die letzten beiden Einschränkungen ergeben sich aus den anatomischen Zwängen der Zebrafischbrust und des Herzens. Drittens erfordert die winzige Größe des erwachsenen Zebrafischherzens eine drastische Verringerung der Anzahl der EKG-Leitungen. Während Menschen in einer Standard-EKG-Aufnahme problemlos zwölf Leads aufnehmen, können erwachsene Zebrafische in der Regel nur ein einziges unipolares oder bipolares Blei aufnehmen. Die Verzweigung eines einzelnen EKG-Leads ist die Herausforderung, gleichzeitig die Amplituden aller drei P-, R- und T-Wellen zu optimieren. Daher kann die Bedeutung einer optimalen und genauen Bleiplatzierung in Zebrafisch-EKG-Verhören nicht überbewertet werden. Bei Zebrafischen stellt die T-Welle eine einzigartige Entdeckungsherausforderung dar, da sie oft die kleinste dieser drei Wellen ist. Daher sollte die Zebrafisch-T-Wellenamplitude Optimierungspriorität gegenüber den typischerweise größeren P- und R-Wellen erhalten.
Viertens kann die Bestimmung der Hauptherzachse des Zebrafisches zur Maximierung der R-Wellenamplitude eine Herausforderung sein. Der Grund dafür ist, dass das Zebrafischherz in seinem lockeren Perikardsack mehr Bewegungsfreiheit hat als das menschliche Herz in seinem formschlüssigen Handschuh-ähnlichen Perikard.
Insgesamt werden diese Beschränkungen die zukünftige Methodinnovation fördern. Mit dem Aufkommen des 3D-Drucks und der verformbaren Elektronik18besteht die Hoffnung auf eine direkte Bleiimplantation eines Tages in wach, wachsam, schwimmenden Zebrafischen mit einer “Herzsocke” von drahtlosen Elektrodensensoren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01 HL141452 bis TPN unterstützt. ADInstruments stellte freundlicherweise großzügige Mittel zur Verfügung, um die Kosten für open access Publishing zu tragen, spielte aber weder bei experimentellem Design, Datenerfassung, Datenanalyse dieser Studie noch bei dem Zugang zum Manuskript vor der Veröffentlichung eine Rolle.
Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |