Elaborazione della coltura embrionale, del guscio d'uovo e fungina per la microscopia elettronica a scansione

Summary

Qui presentiamo protocolli di elaborazione dettagliati per l’imaging di campioni di tessuti delicati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per la preparazione di gusci d’uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo, l’essiccazione dell’aria semplice e l’essiccazione a punti critici, sono descritti per la preparazione di gusci d’uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo e colture fungine.

Abstract

Sebbene la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia ampiamente utilizzata per l’analisi ultrastrutturale di vari campioni biologici e non biologici, i metodi coinvolti nell’elaborazione di diversi campioni biologici coinvolgono pratiche uniche. Tutte le pratiche convenzionali descritte nella letteratura per l’elaborazione dei campioni trovano ancora applicazioni utili, ma sottili cambiamenti nella preparazione dei campioni possono alterare la qualità dell’immagine, così come, introdurre artefatti. Pertanto, l’utilizzo di una tecnica di preparazione campione unica specifica per il tipo di tessuto analizzato è necessario per ottenere un’immagine di buona qualità con risoluzione ultrastrutturale. L’obiettivo di questo studio è fornire i protocolli ottimali di preparazione del campione per l’imaging di embrioni, gusci d’uovo rigidi e colture fungine utilizzando SEM. Le seguenti ottimizzazioni sono state raccomandate per produrre buoni risultati per i tre diversi delicati campioni biologici studiati. L’uso di fissativi più lievi come 4% paraformaldeide o 3% glutaraldeide seguita da disidratazione con serie di etanolo è obbligatorio. Il micelio fungino sui blocchi di agar ottenuti dalle colture di scorrimento produce una migliore integrità ultrastrutturale rispetto alle colture prese direttamente dalle piastre di agar. L’essiccazione chimica degli embrioni con HMDS fornisce l’essiccazione senza introdurre artefatti di tensione superficiale rispetto all’essiccazione a punti critici. HMDS previene la fessurazione causata dal restringimento poiché i campioni sono meno fragili durante l’essiccazione. Tuttavia, per la coltura fungina, l’essiccazione a punti critici fornisce una qualità dell’immagine accettabile rispetto all’essiccazione chimica. I gusci d’uovo possono essere immagini senza particolari passaggi di preparazione, ad eccezione del lavaggio completo e dell’essiccazione dell’aria prima del montaggio. Le metodologie di preparazione sono state standardizzate in base alla qualità accettabile dell’immagine ottenuta con ogni prova.

Introduction

L’analisi ultrastrutturale del microscopio elettronico a scansione (SEM) e l’imaging intracellulare completano la microscopia luminosa per la profilazione tridimensionale di procadioti, piante e animali. L’elevata risoluzione spaziale di un SEM lo rende una delle tecniche più versatili e potenti disponibili per l’esame delle caratteristiche microstrutturali dei campioni su scala nanometrica a micrometro. Gli esemplari desicizzati sono deferiti a strutture compositive e topografiche con intensi dettagli, che forniscono le basi per lo sviluppo di valide conclusioni sulle relazioni funzionali^{1,2,3 , 4 DEL psu’ , 5} Del numero 3( ^{, 6} È possibile: ^{, 7} (in questo stato ^{, 8} (IN vio ^{, 9}. Quando si interpretano immagini SEM di campioni biologici, è una grande sfida distinguere tra le strutture native e gli artefatti creati durante la lavorazione. SeM è generalmente azionato a vuoto molto elevato per evitare interferenze da molecole di gas che interessano i fasci di elettroni primari, secondari o backscattered emessi dal campione^10,11. Inoltre, i materiali biologici sono soggetti a danni da radiazioni a causa delle loro proprietà scarse o non conduttrici. È essenziale che gli esemplari caricati nel SEM siano completamente asciutti e privi di contaminanti organici per eliminare ogni possibile outgassing in un ambiente ad alto vuoto^10,11. Poiché gli esemplari biologici sono per lo più composti da acqua, sono necessarie tecniche di preparativa aggiuntive per garantire che le strutture native siano mantenute.

La risoluzione ottenuta si basa sull’ottimizzazione dei metodi di preparazione specifici per i tipi di campioni e i parametri strumentali utilizzati. Pertanto, è necessario evitare l’utilizzo di passaggi di elaborazione generalizzati per tutti i tipi di tessuto. Alcuni campioni biologici richiederanno una lavorazione meno rigorosa per preservare la loro struttura, mentre potrebbero essere necessari più tempo e cura per i tipi delicati di campioni per evitare l’introduzione di manufatti di essiccazione, come il restringimento e il collasso. La preparazione del campione è un passaggio critico nell’imaging SEM; i risultati degli studi morfometrici sono notevolmente influenzati dalle procedure di preparazione dei campioni^12,13. Le misure di preparazione comuni per molti campioni biologici sono fissazione, disidratazione e rivestimento con un metallo come oro, platino o palladio per convertire le loro superfici in conduttivo per l’analisi SEM. La natura e la combinazione dei passi utilizzati variano a seconda del tipo di tessuto e degli obiettivi specifici dello studio. L’accumulo di carica, la sensibilità al danno del vuoto e del fascio di elettroni pongono problemi durante l’elaborazione di campioni biologici delicati morbidi, che richiedono ulteriori fasi di lavorazione per mantenere la struttura nativa dell’oggetto. L’utilizzo di metodi convenzionali come il fissaggio del tetrossido di osmio e la disidratazione causano restringimento e il collasso di tessuti delicati^14,15,16,17. Lo scopo dello studio è quello di stabilire metodologie eleganti derivate combinando idee da studi precedenti con modifiche per preparare e immagini tessuti delicati morbidi (ad esempio, embrioni di rettili, guscio d’uovo di tartarughe dipinte e colture fungine).

La scelta di un metodo di fissaggio adatto è il primo passo più importante per l’analisi microscopica di campioni biologici. Fissare i tessuti immediatamente dopo l’isolamento da un organismo è essenziale per prevenire l’alterazione nella loro morfologia a causa della decomposizione. Un efficace fissativo dovrebbe terminare i processi cellulari permeando rapidamente le cellule e mantenendo l’effetto in modo irreversibile per stabilizzare la struttura del campione per resistere a entrambe le fasi di elaborazione successive e l’esame ai sensi del SEM^{17 , 18.}Sebbene siano noti diversi metodi di fissaggio chimici e fisici, la fissazione chimica è più comunemente utilizzata per i campioni biologici per evitare qualsiasi cambiamento cellulare dovuto all’autolisi, alla putrefazione e agli effetti di essiccazione. Ci sono numerose formulazioni chimiche fissative discusse nella letteratura^{17,19,20,21,22,23}, fissativi che funzionano denatura e coagulando macromolecole biologiche, e quelle che si fissano covalentmente incrociando macromolecole. Gli alcoli sono utilizzati come fissativi didenazione che conservano l’ultrastruttura molto scarsa e sono utilizzati principalmente per la microscopia leggera e non raccomandati per l’analisi microscopica elettronica. I fissativi come la formaldeide, la glutaraldeide e il tetrossido di osmio creano un incrocio intermolecolare e intramolecolare tra macromolecole all’interno dei tessuti, fornendo un’eccellente conservazione delle ultrastrutture^{11 ,24,25,26}. I campioni biologici sono sensibili alla temperatura. La temperatura all’inizio della fissazione è raccomandata per essere di 4 gradi centigradi per ridurre la mobilità laterale delle proteine della membrana, per rallentare la diffusione delle molecole intercellulari e rallentare il tasso di fissazione¹¹. Il tempo necessario per fissare i tessuti dipende in gran parte dalle dimensioni del campione e dalla velocità con cui il fissativo diffonde e reagisce con i componenti del campione. Una fissazione notturna in paraformaldeide del 4% o 3% di glutaraldeide in PBS a 4 gradi centigradi è il metodo preferito per l’analisi SEM dei campioni utilizzati in questo studio per le loro proprietà penetranti sequenziali, che consentono l’elaborazione di campioni delicati più piccoli^{17 , 18} mi lato ^{, 19} del 12 ^{, 20 anni , 27}. Una fase post-fissazione con tetrossido di osmio viene eliminata non solo a causa della sua natura tossica, ma anche per non implementare alcun vantaggio aggiuntivo per migliorare la qualità dell’immagine per i campioni analizzati in questo studio.

I campioni biologici contengono fluidi che interferiscono con l’operazione SEM; quindi, i campioni devono essere essiccati prima di inserirlo nella camera campione SEM. Una volta garantita la disidratazione, il solvente deve essere rimosso dal tessuto senza creare artefatti nei campioni a causa della tensione/essiccazione superficiale. Sono stati comunemente utilizzati tre diversi metodi di essiccazione durante la lavorazione dei tessuti per l’imaging SEM: essiccazione dell’aria, essiccazione a punti critici e congelamento dei campioni di essiccazione^28,29,30,31. Pochi studi riportano tutti e tre i metodi di essiccazione producendo risultati identici con campioni di tessuto animale^28,29,30,31. Una pratica generale utilizzata per i campioni più piccoli è la disidratazione chimica mediante la concentrazione crescente di serie di alcol e hexamethyldisilazane (HMDS), ma i campioni più grandi vengono essiccati utilizzando uno strumento di essiccazione a punti critici (CPD)³². Durante il processo di essiccazione, notevoli forze formate in piccole cavità che vengono passate attraverso il campione da un’interfaccia liquido/gas; questo può anche portare ad un crollo completo delle strutture cave³³. Qualsiasi deformazione dovuta al trattamento potrebbe quindi essere scambiata come caratteristica strutturale nativa del campione. Pertanto, il fenomeno generalizzato per la lavorazione dovrebbe essere eliminato e un processo di essiccazione unico dovrebbe essere standardizzato per ogni tipo di tessuto, soprattutto quando vengono analizzati campioni di tessuto delicati.

In diversi studi condotti utilizzando varie combinazioni di tutti i processi di cui sopra, abbiamo standardizzato i metodi che possono essere utilizzati per l’analisi SEM di tre tessuti delicati: embrioni di rettili, gusci d’uovo di tartarughe dipinte e colture fungine. I biologi e i morfologi dello sviluppo descrivono la morfogenesi normale e anormale durante lo sviluppo dell’embrione in animali vertebrati rappresentativi. Le indagini sulle vie di segnalazione genica dipendono dalla descrizione morfologica di nuove strutture. Per evitare bruschi cambiamenti nella struttura dell’embrione dei vertebrati durante l’analisi SEM, si consiglia l’essiccazione chimica dopo la disidratazione. L’essiccazione chimica con HMDS è il metodo di essiccazione relativamente più recente e i vantaggi includono la relativa rapidità, la facilità d’uso, la perdita dei costi e la limitata competenza e le attrezzature necessarie⁹. Il CPD è una tecnica di essiccazione comunemente utilizzata che utilizza il passaggio di CO₂ attraverso i campioni a una temperatura e pressione specifiche. Abbiamo identificato che hmDS è adatto per l’essiccazione di tessuti delicati molli e consente di elaborare campioni più grandi rispetto all’essiccazione a punti critici, che ha causato un’estesa deformazione ai tessuti embrionali. Sono stati utilizzati diversi metodi per preparare campioni per l’imaging SEM per studiare le caratteristiche morfologiche dei funghi^{34 .} Gli esemplari fungini sono comunemente fissati nel tetrossido di osmio seguito da disidratazione dell’etanolo e essiccazione a punti critici, che può fornire risultati soddisfacenti, anche se gli effetti tossici del tetrossido di osmio^6,7,35 e perdere materiali fungini mentre si cambiano le soluzioni durante la lavorazione sono svantaggi pronunciati. Anche la tecnica di preparazione dei campioni che utilizza l’essiccazione ad aria senza fissazione è stata praticata^36, ma si traduce in strutture rimpicciolite e collassate, e l’osservazione di tali campioni può essere facilmente interpretata erroneamente mentre caratterizza la specie. L’hypha fungina perde la sua integrità a contatto con i liquidi e un’essiccazione uniforme potrebbe non essere raggiunta per ripristinare la struttura. A causa di questo effetto, l’essiccazione automatica è comunemente usata per asciugare tessuti molli come il micelio fungino. L’essiccazione congelante funziona bene per i materiali puliti, ma la presenza di sali o secrezioni oscurerà i dettagli superficiali che saranno identificati solo nella fase di visualizzazione SEM. Abbiamo accoppiato il metodo di coltura slide con il fissaggio della glutaraldeide e l’essiccazione dei punti critici per produrre dettagli strutturali di hyphae e spore fungine intatte. Anche se l’essiccazione da CPD ha causato restringimento negli embrioni, ha portato a strutture miceliali ben conservate quando accoppiato con fissazione della glutaraldeide. Il guscio d’uovo è di primaria importanza per l’embrione di animali ovipari non solo agendo come copertura protettiva, ma fornendo anche stabilità meccanica, permeabilità al gas e all’acqua e una riserva di calcio per l’embrione in via di sviluppo. I gusci delle uova di tartaruga d’acqua dolce sono classificati come “rigidi” in base alla loro struttura, e grazie alla loro disponibilità hanno ricevuto un’attenzione significativa dai biologi^{1,2,3,4 , 5} Del numero 3( ^{, 6} È possibile: ^{, 7} (in questo stato ^{, 37 Mi} lasa’ di ^{, 38}.

Dettagliamo metodi semplici per un facile esame delle membrane di guscio e guscio di tartaruga dipinta che può essere applicato a qualsiasi specie rigida di guscio d’uovo. Le metodologie di preparazione sono state valutate in base alla qualità dell’immagine risultante e alla riduzione dei potenziali artefatti.

Protocol

NOTA: le uova di tartaruga dipinta (Chrysemys picta) utilizzate in questo studio sono state raccolte durante la stagione di nidificazione da maggio a giugno 2015-16 dalla Rice Creek Field Station, Oswego New York con il permesso ottenuto dal Dipartimento ambientale dello Stato di New York Conservazione (DEC). 1. Metodo di essiccazione chimica per la lavorazione degli embrioni per SEM Raccogli le uova di tartaruga dai campi durante la stagione della nidificazione. Preparare i…

Representative Results

La figura 1 mostra l’analisi micrografica elettronica a scansione degli embrioni della tartaruga dipinta (Chrysemys picta). Per l’imaging SEM sono state utilizzate uova di tartaruga verniciate raccolte e incubate su un supporto da letto, montate su mozziconi di alluminio a seguito di essiccazione chimica (Figura 1A-E). Una vista laterale di un embrione di fase 12 mostra le strutture craniofacciali; la prominenza mascellare si estende o…

Discussion

Nel nostro studio, diversi agenti di fissazione, metodi di disidratazione e essiccazione sono stati testati per preparare tre diversi campioni biologici delicati per l’imaging SEM: embrioni, gusci di uova e colture fungine. SeM è comunemente usato per l’analisi della superficie, quindi la penetrazione fissativa è meno preoccupante, ma bisogna capire che strutture interne scarsamente fissate causeranno restringimento verso l’interno o/e strutture superficiali collassate. Il tempo di fissazione prolungato deve essere con…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy