Prosessering embryo, eggeskall, og fungal kultur for Scanning Electron mikroskopi

Summary

Her presenterer vi detaljerte behandlingsprotokoller for Imaging delikate vevsprøver ved hjelp av skanning elektron mikroskopi (SEM). Tre ulike behandlingsmetoder, nemlig hexamethyl disilazana (HMDS) kjemisk tørking, enkel lufttørking og kritisk punkt tørking er beskrevet for å forberede stive eggeskall, embryo på tidlige utviklingsmessige stadier, og fungal kulturer hhv.

Abstract

Selv om skanning elektron mikroskopi (SEM) blir mye brukt for den ultra-strukturelle analyse av ulike biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder involvert i behandling av ulike biologiske prøver innebære unik praksis. Alle konvensjonelle praksiser beskrevet i litteraturen for behandling prøvene fortsatt finne nyttige programmer, men subtile endringer i prøven preparatet kan endre bildekvalitet, samt, innføre artefakter. Herav, benytter en enestående eksemplar forberedelse teknikk spesifikk å typen av tissue analysert er krevde å få en fint kvalitet image med ultrastructural resolution. Fokuset i denne studien er å gi den optimale prøven forberedelse protokoller for Imaging embryo, stive eggeskall, og fungal kulturer bruker SEM. Følgende optimaliseringer ble anbefalt å gi gode resultater for de tre forskjellige delikate biologiske prøver studert. Bruk av mildere fiksativene som 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde etterfulgt av dehydrering med etanol-serien er obligatorisk. Fungal mycel på agar blokker innhentet av lysbilde kulturer gir en bedre ultrastructural integritet i forhold til kulturer tatt direkte fra agar plater. Kjemisk tørking av embryo med HMDS gir tørking uten å innføre overflate spennings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørking. HMDS hindrer sprekker forårsaket av krymping som prøvene er mindre sprø under tørking. For sopp kultur gir imidlertid kritisk punkt tørking akseptabel bildekvalitet sammenlignet med kjemisk tørking. Eggeskall kan bli avbildet uten spesielle Forberedelses trinn, bortsett fra grundig vasking og lufttørking før montering. Forberedelses metoder ble standardisert basert på akseptabel bildekvalitet oppnådd med hvert forsøk.

Introduction

Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastructural analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensjonal profilering av prokaryoter, planter og dyr. Den høye romlig oppløsning av en SEM gjør den til en av de mest allsidige og kraftige teknikker tilgjengelig for undersøkelse av mikrostrukturelle karakteristikker av prøvene på nanometer til mikrometer skala. Desiccated prøver løses til struktur og topografiske strukturer med intense detaljer, som gir grunnlaget for å utvikle gyldige konklusjoner om funksjonelle forhold^{1,2,3 , 4} andre priser ^{, 5} andre priser ^{, 6} andre priser ^{, 7} andre er ^{, 8} på alle ^{, 9}. Når tolke SEM bilder av biologiske prøver, er det en stor utfordring å skille mellom innfødte strukturer og gjenstander som er opprettet under behandling. SEM er generelt operert ved svært høye vacuums å unngå interferens fra gass molekyler som påvirker den primære, sekundære eller tilbakespredte elektron bjelker slippes ut fra prøven^10,11. Også biologiske materialer er mottakelige for stråling skader på grunn av deres fattige eller ikke-gjennomfører egenskaper. Det er viktig for prøvene lastet inn i SEM å være helt tørt og fritt for eventuelle organiske forurensninger for å eliminere eventuelle outgassing i et høyt vakuum miljø^10,11. Som biologiske prøver er hovedsakelig sammensatt av vann, ytterligere preparativ teknikker er nødvendig for å sikre at de innfødte strukturene beholdes.

Oppløsningen oppnådd er basert på optimalisering forberedelser metoder spesifikke for prøvetyper og instrumental parametre utnyttet. Derfor er det nødvendig å unngå å bruke generalisert behandlingstrinn for alle vevstyper. Noen biologiske prøver vil kreve mindre strenge prosessering for å bevare sin struktur, mens mer tid og omsorg kan være nødvendig for delikate typer prøver for å unngå innføring av tørking gjenstander, for eksempel krymping og kollaps. Prøve utarbeidelse er et kritisk trinn i SEM Imaging; funnene i morphometric studier er bemerkelsesverdig påvirket av prøve Forberedelses prosedyrer^12,13. Felles forberedelse skritt for mange biologiske prøver er fiksering, dehydrering og belegg med et metall som gull, platina eller Palladium å konvertere sine overflater for å være ledende for SEM analyse. Naturen og kombinasjonen av trinnene som brukes vil variere avhengig av type vev, og de konkrete målene for studien. Lad oppbygging, følsomhet for vakuum og elektronstråle skade utgjør problemer ved behandling av myke delikate biologiske prøver, nødvendiggjør ytterligere behandlingstrinn for å beholde den opprinnelige strukturen av objektet. Ved hjelp av konvensjonelle metoder som Osmium tetroxide festing, og dehydrering forårsake krymping og sammenbruddet av delikate vev^14,15,^16,17. Målet med studien er å etablere elegante metoder avledet ved å kombinere ideer fra tidligere studier med modifikasjoner for å forberede og bilde myke delikate vev (f. eks, reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder, og fungal kulturer).

Valg av en passende feste metode er det første viktigste steget for mikroskopisk analyse av biologiske prøver. Fikse vevet umiddelbart etter isolere fra en organisme er avgjørende for å hindre endring i deres morfologi på grunn av nedbrytning. En effektiv bindemiddel bør avslutte cellulære prosesser ved permeating cellene raskt og opprettholde effekten irreversibelt å stabilisere strukturen av prøven til å tåle både påfølgende behandling trinn og undersøkelse under SEM^{17 , 18}. selv om flere kjemiske og fysiske fiksering metoder er kjent, kjemisk fiksering er mer vanlig å bruke for biologiske prøver å unngå eventuelle cellulære endringer på grunn av autolyse, forråtnelse, og tørking effekter. Det er mange bindemiddel kjemiske formuleringer diskutert i litteraturen^17,19,20,21,^22,23, fiksativene som fungerer ved denaturering og coagulating biologiske makromolekyler, og de som løser ved covalently kryss-linking makromolekyler. Alkoholer brukes som denaturering fiksativene som bevarer Ultrastructure svært dårlig og brukes mest for lette mikroskopi og ikke anbefalt for elektron mikroskopisk analyse. Cross-Linking fiksativene som formaldehyd, glutaraldehyde, og Osmium tetroxide skape Intermoleylære og intramolekylær Cross Linking mellom makromolekyler innen vev, gir utmerket bevaring av ultra-strukturer^{11 ,24,25,26}. Biologiske prøver er følsomme for temperatur. Temperaturen i begynnelsen av fiksering anbefales å være 4 ° c for å redusere den laterale mobilitet av membran proteiner, for å bremse spredningen av intercellulære molekyler, og for å bremse hastigheten på fiksering¹¹. Tiden som kreves for å fikse vev avhenger i stor grad av størrelsen på prøven og hastigheten som bindemiddel diffunderer og reagerer med komponentene i prøven. En overnatting fiksering i 4% paraformaldehyde eller 3% glutaraldehyde i PBS ved 4 ° c er den foretrukne metoden for SEM analyse av prøver som brukes i denne studien for deres sekvensielle penetrative egenskaper, som tillater mindre delikate prøver å bli behandlet^{17 , 18 av år , 19} andre priser ^{, 20} priser og ^{, 27}. en post-fiksering trinn med Osmium tetroxide elimineres ikke bare på grunn av sin giftige natur, men også funnet å gjennomføre ingen ekstra fordel å forbedre bildekvaliteten for prøvene analysert i denne studien.

Biologiske prøver inneholder væsker som forstyrrer SEM-operasjonen; derav, prøvene må tørkes før du setter den i SEM prøve kammer. Når dehydrering er sikret, må løsemiddel fjernes fra vevet uten å skape gjenstander i prøvene på grunn av overflaten spenning/tørking. Tre forskjellige tørking metoder ble ofte brukt under prosessering vev for SEM Imaging: lufttørking, kritisk punkt tørking, og frysetørking prøver^28,29,30,31. Få studier rapporterer alle tre tørking metoder som produserer identiske resultater med animalsk vev prøver^28,29,30,31. En generell praksis som brukes for mindre eksemplarer er kjemisk dehydrering av stigende konsentrasjons serie av alkohol og hexamethyldisilazane (HMDS), men større eksemplarer er tørket ved hjelp av et kritisk punkt tørking (CPD) instrument³². Under tørkeprosessen, store krefter dannet i små hulrom som er gått gjennom prøven med en væske/gass-grensesnitt; Dette kan også føre til en fullstendig kollaps av hul strukturene³³. Enhver deformasjon som oppstår på grunn av behandlingen kan deretter forveksles som en innfødt strukturell funksjon av prøven. Dermed bør generalisert fenomen for behandling elimineres og en unik tørkeprosessen bør være standardisert for hver type vev spesielt når delikate vevsprøver analyseres.

I flere forsøk utført ved hjelp av ulike kombinasjoner av alle de ovennevnte prosesser, standardiserte vi metodene som kan brukes til SEM analyse av tre delikate vev: reptil embryo, eggeskall av malte skilpadder og sopp kulturer. Utviklingsmessige biologer og morphologists beskriver normal og unormal morphogenesis under embryoutvikling i representative virveldyr dyr. Undersøkelser på gen signalering trasé avhenge av morfologiske beskrivelse av romanen strukturer. For å unngå brå endringer i embryo Foster strukturen under SEM-analyse, anbefaler vi kjemisk tørking etter dehydrering. Kjemisk tørking ved hjelp av HMDS er den relativt nyeste tørke metoden og fordelene inkluderer relativ hurtighet, brukervennlighet, tapt kostnad, og den begrensede kompetansen og utstyret som trengs⁹. CPD er en ofte brukt tørking teknikk ved hjelp passaging CO₂ over prøvene ved en bestemt temperatur og trykk. Vi identifiserte at HMDS er egnet for tørking mykt delikat vev og tillater større prøver å bli behandlet i forhold til kritisk punkt tørking, noe som forårsaket omfattende deformasjon til embryonale vev. Flere metoder har blitt brukt til å forberede prøvene for SEM Imaging å studere morfologiske karakteristikker av sopp³⁴. Sopp prøver er vanligvis løst i Osmium tetroxide etterfulgt av etanol dehydrering og kritisk punkt tørking, som kan gi tilfredsstillende resultater, selv om toksiske effekter av Osmium^tetroxide35 og miste sopp materialer mens skiftende løsninger under behandling er uttalt ulemper. Prøven forberedelse teknikken bruker luft-tørking uten fiksering har også vært praktisert³⁶ men resulterer i krympet og kollapset strukturer, og observasjon av slike prøver kan lett bli misforstått mens karakteriserer arten. Fungal hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en enda tørking kan ikke oppnås for å gjenopprette strukturen. På grunn av denne effekten, fryse-tørking brukes vanligvis for tørking bløtvev som sopp mycel. Frysetørking fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen av noen salter eller sekresjon vil skjule overflate detaljer som vil bli identifisert bare på SEM ser scenen. Vi koblet raset kulturen metoden med glutaraldehyde festing og kritisk punkt tørking å gi strukturelle detaljer intakt fungal hyfer og sporer. Selv om CPD tørking forårsaket krymping i embryo, resulterte det i godt bevarte Mycelial strukturer når kombinert med glutaraldehyde fiksering. Eggeskall er av primær betydning for fosteret av oviparous dyr ved å ikke bare opptre som en beskyttende dekker, men også gi mekanisk stabilitet, permeabilitet til gass og vann, og en kalsium Reserve for utviklingsland embryo. Freshwater Turtle eggeskall er klassifisert som “rigid” basert på deres struktur, og på grunn av deres tilgjengelighet har fått betydelig oppmerksomhet fra biologer^{1,2,3,4 , 5} andre priser ^{, 6} andre priser ^{, 7} andre er ^{, 37} for alle ^, i ³⁸.

Vi detaljer enkle metoder for enkel undersøkelse av eggeskall og skall membraner av malte skilpadde som kan brukes på alle stive eggeskall arter. Forberedelses metoder ble evaluert basert på resulterende bildekvalitet og reduserte potensielle artefakter.

Protocol

Merk: malt skilpadde (Chrysemys picta) egg brukt i denne studien ble samlet i løpet av hekkende sesongen av mai til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillatelse innhentet fra New York State Department of Environmental Bevaring (desember). 1. kjemisk tørking metode for å behandle embryo for SEM Samle skilpadde egg fra feltet områder i hekketiden. Forbered inkubasjons kamre på forhånd, laget av plast bokser med lokk (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 …

Representative Results

Figur 1 Vis skanning elektron hhv analyse av malt skilpadde (Chrysemys picta) embryo. Malte skilpadde egg samlet og inkubert på et sengetøy medium, montert på aluminium stubber etter kjemisk tørking ble brukt for SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning av en etappe 12 embryo viser kraniofacial strukturer; maksillære prominence strekker seg utover søvnapnéskinne og begrenser en godt merket nese pit anteriort; fem pharyngeal b…

Discussion

I vår studie, ulike fiksering agenter, dehydrering og tørking metoder ble testet for å forberede tre ulike delikate biologiske prøver for SEM Imaging: embryo, eggeskall, og fungal kulturer. SEM er vanligvis brukes til overflate analyse, så bindemiddel penetrasjon er mindre om, men det må forstås at dårlig fast indre strukturer vil føre innover krymper eller/og kollapset overflatestrukturer. Forlenget fiksering tid bør også vurderes for større vevsprøver, erstatte bindemiddel løsningen et par ganger avhengig…

Materials

Agar	Fischer Scientific	S25127A	for slide cultures
Aluminum pin stub	Tedpella	16111	12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar	BD 213400	DF0013-17-6	Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol	Fischer BioReagents	BP904-100	Antibiotic for media
Coarse Vermiculite	Greenhouse Megastore	SO-VER-12	bedding medium
Clear 12- well plate	Corning	07-201-589	for fixing embryo
Coverslips	Fischer Scientific	S17525B	for slide culture
Critical Point Dryer	Quorum CPD	EMS850	critical point drying
Culture dishes	Fischer Scientific	08 747B	DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol	Fischer Scientific	A406P 4	dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers	Tedpella	5804	style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde	Fischer Scientific	G151-1	fixative
Gold target for sputter coater	DENTON VACUUM	TAR001-0158	Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana	Fischer Scientific	C19479-5000	chemical drying agent
Kim wipes	Kimtech	S-8115	cleaning
Microscope slides	Thermo Scientific	67-762-16	for slide culture
Microscopy Scissors	Tedpella	1327	Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors	Tedpella	1346	Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts	Corning	0330B09	15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde	Fischer Scientific	T353 500	fixative
Peat moss	Walmart- Miracle Gro	551705263	bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape	Tedpella	5000	12 mm OD
Sputter coater	DENTON VACUUM	DESK V	thin metal coating
SEM	JEOL USA	JEOL JSM 6610LV scanning electron scope	electron microscopy