एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति का उपयोग कर मक्का Mitochondrion में प्राथमिक और प्रसंस्कृत ट्रांसस्क्रिप्ट के भेदभाव और मानचित्रण
Summary
हम परिपत्र आरटी-पीसीआर, मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, आरएनए 5′ पॉलीफॉस्फेटस-उपचार, और उत्तरी दाग के संयोजन के द्वारा एक परिपत्र आरटी-पीसीआर आधारित रणनीति प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल अस्थिर 5′ ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक सामान्यीकरण कदम भी शामिल है, और यह भेदभाव और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि stably मक्का mitochondrion में जमा मानचित्रण के लिए उपयुक्त है.
Abstract
संयंत्र mitochondria में, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि 5′ triphosphate प्रतिलेखन दीक्षा (प्राथमिक प्रतिलिपि) से व्युत्पन्न है, जबकि अन्य होते हैं 5′ मोनोफॉस्फेट उत्पन्न पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनलली (प्रसंस्कृत प्रतिलिपि). दो प्रकार की प्रतिलिपियों के बीच भेदभाव करने के लिए, कई रणनीतियों को विकसित किया गया है, और उनमें से अधिकांश 5′ ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव पर निर्भर करते हैं। हालांकि, प्राथमिक 5′ टर्मिनी पर ट्राइफॉस्फेट अस्थिर है, और यह दो प्रकार के ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालता है। मक्का माइटोकोन्ड्रियोन में जमा प्राथमिक और प्रसंस्कृत प्रतिलिपियों में व्यवस्थित रूप से अंतर और मैप करने के लिए, हमने सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5′ पॉलीफोशपैटस उपचार, मात्रात्मक के संयोजन से एक परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर) आधारित रणनीति विकसित की है। आरटी-पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर), और उत्तरी दाग। एक सुधार के रूप में, इस रणनीति अस्थिर 5′ ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए एक आरएनए सामान्यीकरण कदम भी शामिल है।
इस प्रोटोकॉल में, समृद्ध माइटोकोंड्रियाल आरएनए का आरएनए 5′ पॉलीफॉस्फेट द्वारा पूर्व-उपचार किया जाता है, जो 5′ त्रिफॉफेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है। परिपत्रीकरण और रिवर्स प्रतिलेखन के बाद, 5′ पॉलीफॉस्फेटसे से व्युत्पन्न दो सीडीएनए इलाज और गैर-उपचारित आरएनए को मक्का 26एस परिपक्व आरएनए द्वारा सामान्यीकृत किया जाता है, जिसमें एक संसाधित 5′ अंत होता है और 5′ पॉलीफॉस्फेटस के प्रति असंवेदनशील होता है। सामान्यीकरण के बाद, प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि इलाज और गैर इलाज RNAs से प्राप्त cRT-PCR और आरटी-QPCR उत्पादों की तुलना द्वारा भेदभाव कर रहे हैं। ट्रांसक्रिप्ट टर्मिनी को cRT-PCR उत्पादों की क्लोनिंग और अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जाता है, और फिर उत्तरी दाग द्वारा सत्यापित किया जाता है।
इस रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि निर्धारित किया गया है. कुछ mitochondrial जीन की जटिल प्रतिलिपि पैटर्न के कारण, कुछ स्थिर राज्य प्रतिलिपि भेदभाव नहीं थे और / हमें यकीन है कि नहीं कर रहे हैं कि इस रणनीति के लिए भेदभाव और अन्य संयंत्र mitochondria में या प्लास्टिड में स्थिर राज्य प्रतिलिपि नक्शा उपयुक्त है.
Introduction
संयंत्र mitochondria में, कई परिपक्व और अग्रदूत आरएनए कई आइसोफॉर्मकेस के रूप में जमा कर रहे हैं, और स्थिर राज्य प्रतिलिपि उनके 5 ‘ समाप्त होता है पर अंतर के आधार पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है1,2, 4. प्राथमिक प्रतिलिपि 5′ triphosphate समाप्त होता है, जो प्रतिलेखन दीक्षा से प्राप्त कर रहे हैं. इसके विपरीत, संसाधित प्रतिलिपि है 5′ मोनोफॉस्फेट पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल प्रोसेसिंग द्वारा उत्पन्न. भेदभाव और प्रतिलिपि के दो प्रकार के मानचित्रण के लिए आणविक प्रतिलेखन और प्रतिलिपि अंत परिपक्वता अंतर्निहित तंत्र को जानने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
संयंत्र माइटोकोन्ड्रिऑन में प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों के बीच अंतर करने के लिए, चार प्रमुख रणनीतियों को विकसित किया गया है। पहली रणनीति तंबाकू एसिड पायरोफॉस्टास (टीएपी) के साथ माइटोकोंड्रिल आरएनए का पूर्व उपचार करना है, जो 5′ ट्राइफॉस्फेट को मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित करता है और प्राथमिक ट्रांसक्रिप्टकोआरए लिगेज द्वारा परिपत्रीकृत करने में सक्षम बनाता है। टेप इलाज और गैर इलाज आरएनए नमूनों की प्रतिलिपि बहुतायत तो cDNA समाप्त होता है (आरईएस) या परिपत्र आरटी-पीसीआर (सीआरटी-पीसीआर)2,3,4के तेजी से प्रवर्धन द्वारा तुलना कर रहे हैं। दूसरी रणनीति में, संसाधित प्रतिलिपि सबसे पहले माइटोकोंड्रिल आरएनए से टर्मिनेटर 5′-फॉस्फेट-निर्भर एक्सोनुलेस (टेक्स) का उपयोग करके समाप्त हो जाती है, और प्राथमिक प्रतिलिपियां छोड़ दी जाती हैं फिर प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण द्वारा मैप की जाती हैं5,6 . तीसरी रणनीति के लिए guanylyl transferase का उपयोग कर प्राथमिक प्रतिलिपि पूर्व टोपी है, और फिर triphosphated 5′ टर्मिनी की स्थिति प्राइमर विस्तार द्वारा एक साथ ribonuclease या S1 nuclease संरक्षण विश्लेषण7,8 के साथ निर्धारित किया जाता है ,9. 5′ ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अभाव के आधार पर उन लोगों से अलग, चौथी रणनीति इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन, साइट-निर्देशित म्यूटेजनन, और प्राइमर एक्सटेंशन विश्लेषण को जोड़ती है जो पुटेटिव प्रमोटरों की विशेषता है और प्रतिलेखन निर्धारित करती है दीक्षा स्थल8,10,11. इन रणनीतियों का उपयोग करके, कई प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि संयंत्र mitochondria में निर्धारित किया गया है.
तथापि, कई अध्ययनों से पता चला है कि प्राथमिक प्रतिलिपियों के 5′ ट्राइफॉस्फेट अस्थिर थे, और वे आसानी से अज्ञात कारण2,4,12,13के लिए मोनोफॉस्फेट में परिवर्तित हो गए थे। यह समस्या 5′ ट्राइफॉस्फेट की उपस्थिति/अनुपस्थिति के आधार पर तकनीकों का उपयोग करके दो प्रकार की ट्रांसक्रिप्ट्स के स्पष्ट भेदभाव में बाधा डालती है, और संयंत्र में प्राथमिक और संसाधित ट्रांसक्रिप्ट्स के बीच व्यवस्थित रूप से भेदभाव करने के पिछले प्रयासों में बाधा डालती है। माइटोकोंड्रियाअसफल २,१२.
इस प्रोटोकॉल में, हम सीआरटी-पीसीआर, आरएनए 5′ पॉलीफॉस्फेटस उपचार, आरटी-क्यूपीसीआर, और उत्तरी दाग को व्यवस्थित रूप से मक्का में जमा प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपियों को व्यवस्थित रूप से अलग करने के लिए गठबंधन करते हैं (जीए मई) मिटोकोन्ड्रिऑन (चित्र 1)। cRT-PCR एक आरएनए अणु के 5′ और 3′ extremities के एक साथ मानचित्रण की अनुमति देता है, और यह आमतौर पर पौधों में प्रतिलिपि टर्मिनी नक्शा करने के लिए अनुकूलित किया जाता है2,12,14,15. आरएनए 5′ पॉलीफॉस्फेटेस ट्राइफॉस्फेट5 टर्मिनी से दो फॉस्फेट निकाल सकता है, जो प्राथमिक प्रतिलिपि आरएनए लिगेस द्वारा आत्म-लिगेशन के लिए उपलब्ध बनाता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि मक्का में परिपक्व 26S rRNA 5′ टर्मिनस संसाधित किया था, और यह आरएनए 5 ‘ polyphosphatase1,16के प्रति असंवेदनशील था. प्राथमिक 5′ टर्मिनी पर अस्थिर ट्राइफॉस्फेट के प्रभाव को कम करने के लिए, 5′ पॉलीफॉस्फेटकास-उपचार और गैर-उपचारित आरएनए परिपक्व 26S RRNA द्वारा सामान्यीकृत हैं, और प्राथमिक और संसाधित प्रतिलिपि फिर तुलना करके विभेदित हैं सीआरटी-पीसीआर उत्पादों दो आरएनए नमूनों से प्राप्त की। cRT-PCR मानचित्रण और भेदभाव के परिणाम क्रमशः उत्तरी दाग और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा सत्यापित किए जाते हैं। अंत में, वैकल्पिक प्राइमर उत्तरी दाग में पता चला उन प्रतिलिपियों बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन cRT-पीसीआर द्वारा नहीं. इस cRT-PCR-आधारित रणनीति का उपयोग करके, मक्का mitochondrion में सबसे स्थिर राज्य प्रतिलिपि अलग और मैप किया गया है1.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक पिछले अध्ययन में, Arabidopsis के सेल निलंबन संस्कृति से कुल और mitochondrial आरएनए cRT-पीसीआर द्वारा mitochondrial प्रतिलिपि शब्दावली नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इसी तरह के परिणामप्राप्त किए गए 12. तथ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31600250, वाई.जेड.), गुआंग्झू शहर की विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाओं (अनुदान संख्या 201804020015, एच.एन.) और चीन कृषि अनुसंधान प्रणाली (नहीं) द्वारा समर्थित किया गया था। CARS-04-PS09, एच.एन.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
