Presenteras här är ett protokoll för att utföra Single-molekyl Förster resonans energiöverföring för att studera HJ upplösning. Tvåfärgad omväxlande excitation används för att bestämma dissociationskonstanter. Enfärgad tidsfördröjning smFRET tillämpas sedan i realtid klyvning analyser för att få Dwell tid fördelning före HJ upplösning.
Bulkmetoder mäter Ensemble beteendet hos molekyler, där individuella reaktionshastigheter av de underliggande stegen är genomsnittliga i hela populationen. Single-molekyl Förster resonans Energy Transfer (smFRET) ger en inspelning av de överensstämde förändringar som sker genom enskilda molekyler i realtid. Därför är smFRET kraftfull i att mäta strukturella förändringar i enzymet eller substrat under bindning och katalys. Detta arbete presenterar ett protokoll för Single-molekylen avbildning av samspelet mellan en fyra-vägs Holliday korsning (HJ) och gap Endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homolog rekombination enzym. Också presenteras är enfärgad och tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) smFRET experimentella protokoll för att följa upplösningen av HJ av GEN1 i realtid. Kinetik av GEN1 Dimerization bestäms vid hj, som har föreslagits att spela en nyckelroll i resolutionen av HJ och har förblivit svårfångade tills nu. De tekniker som beskrivs här kan tillämpas i stor utsträckning för att få värdefulla mekanistiska insikter i många enzym-DNA-system.
Enmolekyl-metoder baserade på fluorescensdetektion ger hög signal-till-brus-förhållanden1. FRET är en spektroskopisk teknik som kan mäta avstånd i intervallet 1 – 10 nm, vilket gör denna teknik som en molekylär linjal för att mäta avstånd i nanometer Range2,3. Acceptorens absorptionsspektrum har en partiell spektralöverlappning med givarens emissions spektrum vid den kortare våglängdsänden. FRET förmedlas av strålningen-mindre energiöverföring mellan en givare och acceptor par, medan effektiviteten i energiöverföringen är beroende av avstånd och orientering av acceptor4.
Flera metoder har implementerats för att minimera bakgrunden och förbättra detekterings effektiviteten hos fluorescenssignalen5,6. Ett tillvägagångssätt är konfokalmikroskopi, där ett hål begränsar excitationspotten till en storlek under diffraktionsgränsen7. En annan metod är total inre reflektions fluorescens (TIRF), som är en bred fälts belysning teknik där ljuset riktas off-axeln över en kritisk vinkel8. Ljuset är då helt internt reflekteras i gränssnittet mellan glas och vattenlösning, genererar en försvinnande våg som bara lyser upp fluoroforer fäst vid glasytan och förhindrar bakgrund från fluoroforer i resten av lösningen.
I konfokalmikroskopi kan molekylerna antingen vara fritt diffuserande eller ytimmobiliserade. Den uppnådda temporala upplösningen kan vara inom mikrosekunder till flera millisekunder9. Den konfokala detektering för en enda molekyl utförs av Single-Photon lavin diod (SPAD) och punkt-för-punktskanning av regionen av intresse10. I TIRF, en tidsserie av några hundratals molekyler immobiliserade på ytan registreras av en positions känslig tvådimensionell laddning kopplad detektor (CCD). CCD förstärker fluorescens signalen antingen genom intensifierad fosfor skärm och MicroChannel-plattan eller on-chip multiplikation av photoelektroner (EMCCD). Den temporal upplösningen är anhörigen på avläsning-rusad och quantumeffektivitet av CCD och vanligt på beställa av fåtalet tio av millisekunder6.
HJ är en central intermediär i DNA-reparation och rekombination11,12,13,14. HJ har två kontinuerliga och två korsning strängar som ansluter mellan de kontinuerliga strängarna utan korsande varandra. HJ finns i lösning som X-staplade kon Formations apparater, som genomgår kontinuerlig isomerisering av de kontinuerliga strängarna blir korsning och korsningen strängarna blir kontinuerlig i de andra conformer15. Isomer preferens för hj är beroende av kärnan sekvens och jonisk miljö och har studerats utförligt av FRET16,17,18,19.
GEN120 är ett monomer protein i lösning21 och kräver Dimerization att klyva hj, vilket möjliggör korrekt separation av de rekombinerade delarna22,23. Den stapling conformer preferens för HJ påverkar resultatet av genetisk rekombination genom att fastställa inriktningen av resolutionen av HJ resolvaser24. Förstå hur GEN1 binder hj, samordnar de två snitt, och säkerställer dess fulla upplösning har alla varit under intensiv studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denna studie, en objektiv baserat TIRF set-up används som beskrivs tidigare31. Tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) tillämpas för att bestämma de överensstämde förändringar på samspelet mellan GEN1 med fluorophore märkt HJ. Alex producerar 2D-histogram baserat på två ratiometriska parametrar FRET effektivitet E, som är givare-acceptor avstånd-beroende, och stökiometri parameter S, som mäter donator-acceptor stökiometri32. ALEX möjliggör sortering av fluorescerande arter baserade på stoichiometrier av fluoroforer, inklusive endast givare, acceptor och blandade subpopulationer. ALEX kan förlänga användningen av FRET till hela sortimentet och kan upptäcka skillnader i fluorophore ljusstyrka och oligomerisering samt övervaka makromolekyl-ligand interaktioner33.
Det finns att GEN1 konsekvent lyckas lösa HJ inom livslängden för GEN1-HJ-komplexet. De tidsberoende kon Formations förändringarna härleds från tids spåren av enskilda molekyler, medan histogrammen representerar fördelningen av de underliggande populationerna. Använda Time-lapse enfärgad FRET, snabb på-priser och långsam off-priser för GEN1 dimer demonstreras, vilket ökar affiniteten av den sammansatta GEN1 dimer vid den första snitt produkten.
I denna studie, olika smFRET tekniker genomfördes för att bestämma kinetik av HJ upplösning av GEN130. Liknande smfret metoder användes för att följa dubbel-flik DNA-överensstämmningskrav och klyvning av DNA-replikation och reparation flik Endonuklease 142,43,44. Här diskuteras kritiska steg i detta protokoll. Silaniseringsreaktionen bör vara fri från alla spår av fukt. Pegylationslösningen bör snabbt appliceras på det silaniserade glaset när PEG är upplöst för att undvika hydrolys. I cellen flerkanaligt flöde bör eventuell instängd luft i limmet avlägsnas för att undvika läckage mellan angränsande kanaler. PCA-lösningen bör vara nyberedd eftersom den oxiderar med tiden. Tillsatsen av 10 N NaOH bör vara dropwise, med vortexa däremellan. Fluorescensbakgrunden i täckglåtet bör vara minimal innan du strömmar den Fluorescent som heter HJ. Bildtagning i cellen flöde bör utföras i en riktning för att undvika Imaging blekt områden. I ALEX experiment, kraften i den röda lasern bör reduceras för att undvika snabb blekning av acceptorn. I tids fördröjnings experimenten måste cykelns tid vara kortare än den snabbaste händelsen.
smFRET är en känslig teknik som kan ge värdefulla insikter i realtid i biomolekylära reaktioner. Emellertid, denna metod har flera tekniska utmaningar, bland vilka är att uppnå mätbara förändring i FRET under den biokemiska reaktionen. Detta är nödvändigt för att få väl separerade funktioner i histogrammen och distinguishable stater i tid-spår. I många fall kräver smFRET noggrann utformning av substrat, val av fluorophore par och deras positioner, och förstärkning av FRET förändringar i DNA-substrat på grund av de små strukturella förändringarna i substratet45. En annan metod för att utföra FRET är att använda märkta proteiner46. Observations fönstret i FRET begränsas av stabiliteten i acceptorn som Cy5 eller Alexa fluor 647 som tenderar att bleka snabbare än givaren (Cy3 i detta fall). Därför kräver FRET en kontinuerlig sökning efter stabila fluoroforer att förlänga experimentets varaktighet och ansträngningar för att utveckla syre rensning system för att förlänga fluorescenssignalen och maximera signal-brus-förhållande47,48 .
Bland de tips för felsökning i smFRET balanserar flera parametrar inblandade i Imaging såsom lasereffekt, exponeringstid, cykeltid, och antal cykler för att maximera fluorescensutsläpp, förlänga experimentets varaktighet, och uppnå lämpliga provtagningsintervall för enzymdynamiken. Längre observations tider och minimala effekter från foto blekning är nödvändiga för att erhålla hög fidelity Dwell Time-distributioner som representerar enzymdynamiken. ALEX genererar bättre histogram eftersom denna metod utsätts för lägre bidrag från photoblekt partiklar jämfört med enfärgad FRET. Men den temporala upplösningen i ALEX är lägre än i enfärgad FRET.
Slutligen, smFRET betoning på att upptäcka kon Formations struktur/strukturella förändringar i enskilda molekyler i realtid överbryggar klyftan mellan hög upplösning strukturella tekniker (dvs., röntgen kristallografi, kärnmagnetisk resonans, elektronmikroskopi), som ger atomär upplösning strukturella Detaljer under statiska förhållanden och bulkmetoder som ger ensemblen genomsnittet av en mätbar egenskap. I många avseenden har smFRET visat sig vara en kraftfull teknik för att studera biologiska system i realtid.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av kung Abdullah University of Science and Technology genom Core finansiering och konkurrenskraftig forskning Award (CRG3) till S. M. H.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18×26 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
Drill | Dremel | 200-1/21 | |
Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
HEPES | BDH | BDH4162 | |
Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
Neutravidin | Pierce | 31000 | |
Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
Tris Base | Promega | H5135 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |