Kvantitativ struktur-aktivitetrelation (QSAR) modellering är en representativ bioinformatik-assisterad metod vid toxikologisk screening. Detta protokoll visar hur man på ett beräkningsmässigt sätt bedömer riskerna för hormonstörande ämnen (EDs) i vattenmiljöer. Genom att använda OECD: s QSAR-verktygslåda implementerar protokollet en in silico-analys för analys av hormonstörande ämnen i fisk.
Beräknings analyser av toxikologiska processer möjliggör screening av kemiska ämnen med hög kapacitet och Prediktion av deras endpoints i biologiska system. I synnerhet har modeller för kvantitativ struktur-aktivitetrelation (QSAR) tillämpats alltmer för att bedöma miljöeffekterna av en uppsjö av giftiga ämnen. Under de senaste åren, några mer betonade typer av toxiska ämnen är hormonstörande ämnen (EDs, som är kemikalier som kan störa någon hormonrelaterad metabolism). Eftersom EDs i betydande grad kan påverka djurens utveckling och fortplantning krävs det att man snabbt förutspår de negativa effekterna av EDs med i silico-teknik. Denna studie presenterar en in silico metod för att generera förutsägelse data om effekterna av representativa EDs i vattenlevande ryggradsdjur, särskilt fiskarter. Protokollet beskriver ett exempel som utnyttjar det automatiserade arbetsflödet i QSAR Toolbox-programvaran som utvecklats av organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) för att möjliggöra akuta ekotoxicitetsförutsägelser av EDs. Som ett resultat av detta bestäms följande: (1) beräkning av de numeriska korrelationerna mellan koncentrationen för 50% av dödlighet (LC50) och Fördelningskoefficient oktanol-vatten (Kow), (2) prestanda där LC50 värden som bestäms i experiment jämförs med de som genereras av beräkningar, och (3) beroendet av östrogen receptorbindning affinitet på förhållandet mellan Kow och LC50.
Den nya utvecklingen inom informatik och beräkningsteknik har gett de biologiska vetenskaperna en kvantitativ metodik som ger hög precision och tillförlitlighet1. I synnerhet har algoritmer som används i molekylär taxonomi och egenskaps klassificering resulterat i kvantitativa struktur-aktivitetrelations (QSAR) modeller2. Dessa modeller korrelerar automatiskt de kemiska strukturerna och den biologiska verksamheten i en given kemisk databas och genomför snabbt i silico screening av ett brett spektrum av kemiska substrat enligt deras medicinska eller toxikologiska åtgärder3. QSAR-verktyg kan producera prediktiva toxicitetsprofiler som en funktion av funktions vektorer av molekylära beskrivare (dvs. fysikalisk-kemiska parametrar) av kemikalier av intresse för att numeriskt skapa kategoriska slutpunkter4. Vanligtvis visas varje kvantitativ slutpunkt som en 2D-spridningsdiagram kontra ändringar i deskriptorvärden. En QSAR-modell genereras sedan med hjälp av (flera) linjära regressionsanalyser. När en datauppsättning har utnyttjats fullt ut för att konstruera en QSAR-modell (som kallas tränings uppsättning), är modellen statistiskt verifierad genom att förutsäga slutpunkterna för en grupp av kemikalier som inte ingår i utbildnings uppsättningen (kallas testuppsättningen). Modellen kan sedan användas för att förutsäga biologisk verksamhet av oprövade föreningar3.
Bland många skadliga kemikalier, hormonstörande ämnen (EDs) har lyfts fram som en grupp av gifter som kan störa i många hormonrelaterade metabolismer hos däggdjur, groddjur, och fisk5,6. EDs är kända för att inducera en mängd negativa effekter, såsom cancer och missbildningar, genom att blockera eller förändra normala hormonella vägar eller aktivera onormal hormon syntes/nedbrytnings signaler. Som en följd av detta kan dessa hormon-imitera kemikalier stör endokrina system så att biologisk utveckling och reproduktion av vilda djurpopulationer hämmas. I synnerhet har de ekotoxikologiska effekterna av hormonstörande ämnen undersökts utförligt i vattenlevande ryggradsdjur, som har nästan identiska hormonreceptor strukturer till däggdjur, inklusive människor. Eftersom alla hormonella åtgärder uppträder vid låga doser in vivo, är det avgörande för den offentliga och miljömässiga hälsan att förutsäga de potentiella toxiciteterna hos ED-kandidater som använder snabb i silico screening.
QSAR modeller baserade på toxikologin av EDs har genomförts med hjälp av både 2D-och 3D-deskriptorer (känd som 2D och 3D QSAR, respektive), som avslöjar ED ligand bindande tillhörighet av östrogen, androgen, och progesteronreceptorer7. Trots de höga precisions fördelarna med 3D QSAR, där överensstämningsövergripande och elektrostatiska interaktioner beaktas, behåller 2D QSAR sin egen robusthet i direkta matematiska algoritmer, snabba beräkningar och extremt låga beräknings belastningar. Dessutom är 2D-QSAR-modellerna flexibla för användning i en mängd olika applikationer samtidigt som de uppnår relativt exakt förutsägelse prestanda.
OECD: s QSAR Toolbox är för närvarande en av de mest utnyttjade datorprogram verktyg, ger fritt tillgängliga och färdiga QSAR modeller8,9. Profilerings profiler använder 2D-beskrivnings databaser. Sedan lanseringen av den första versionen i 2008 har programvaran tillämpats inom områdena kemisk och biologisk industri, folkhälsa och miljö säkerhet för fullständig eller partiell analys av de potentiella riskerna med naturliga och syntetiska föreningar, med särskilda intressen i cancerogenesen10,11,12, mutagenicitet13,14,15, och utvecklingstoxicitet16. Ansökan till akvatisk toxikologi har också visats, med fokus på bioackumulering och biotransformation17.
QSAR-verktygslådan har visat sig vara användbar för att förutsäga den kortsiktiga toxiciteten hos ett brett spektrum av kemikalier17, samt den östrogen receptor (er) bindande affiniteter av EDs18. De akuta ekotoxiciteterna av EDs hos vattenlevande ryggradsdjur har dock inte analyserats med hjälp av QSAR-verktygslådan. I denna studie presenteras ett typiskt och facile protokoll för att utföra QSAR-modellering på de akuta negativa effekterna av EDs med fokus på fiskarter. Studien visar att QSAR Toolbox är en programvara med hög tillgänglighet för att beräkna och förutsäga dödlighet hos vattenlevande ryggradsdjur för vissa representativa hormonstörande ämnen. statistiska behandlingsmetoder för härledda i silico-dataset presenteras. Figur 1 visar det övergripande systemet för den allmänna driften av QSAR-verktygslådan. Arbetsflödet som visas i figur 2 innehåller enkla instruktioner om hur man använder in silico-analysen för att förutsäga akut ekotoxicitet av målsubstanser såsom hormonstörande kemikalier.
Mångsidigheten hos OECD: s QSAR-verktygslåda som analytisk programvara för ekotoxikologi visas här med särskilt intresse för de negativa effekterna av hormonstörande kemikalier på vattenlevande ryggradsdjur. Dessutom demonstrerades ett enkelt och standardiserat protokoll för att förutsäga akut toxicitet (96-h LC50) av 74 representativa EDs (tabell 1) för fiskarter. Detta uppnåddes genom tillämpning av kategori byggnad, fyllning av dataluckor och er-profilmoduler inbäddade i QSAR-verktygslådan (figur 1, figur 2).
Den linjära korrelationen mellan log10LC50 ochlog 10Kow med en negativ lutning (som visas i tilläggs siffran S1) har länge varit känd som en standard kvantitativ relation i QSAR-analyser25, där högre toxicitet visas ju mer hydrofoba en given kemikalie är. Som framgår av en enkel beräkning, den allmänna matematiska relationen som innehåller ekvation S1 och ekvation S2 (kompletterande information) är ett konverterat uttryck från följande Power-funktion26:
Från handlingen (ekvation 2) kan det vara möjligt att karakterisera ett mellanliggande intervall av Kow26 genom att justera parametrarna a och b, där en viss variation i hydrofobicitet (eller hydrofilicitet) inte väsentligt förändrar Endpoint av akut toxicitet.
Jämförande analyser mellan beräknings prognoser och experimentella observationer på LC50, som visas i figur 3 och figur 4, har typiskt rapporterats i studier av QSAR för olika akvatiska toxicants, inklusive tekniska icke-jonaktivt tensider27, triazol fungicider28, och pesticiden metaboliter21. Denna typ av retrospektiv validering ger information om hur långt ett givet QSAR-verktyg kan nå när det gäller jämförande resultat med experimentella resultat. I denna studie av akut toxicitet i fisk, var QSAR Toolbox visat sig ge skyddande förutsägelser för över 90% av testade EDs i alla fiskar och i en enda art, Pimephales promelas.
Ytterligare identifiera de tre avvikare kemikalier i figur 3 och figur 4, som visade högre förutspådde LC50 i genomsnitt och till ett minimum, respektive, krävs. Första, den 3 ‘, 5, 7-trihydroxy-4 ‘, 6-dimethoxyisoflavone är en typ av flavonoid (mer specifikt, en isoflavone), som anses vara allmänt säker och används i växtbaserade läkemedel; emellertid, det har fortfarande östrogen-relaterade frågor29 och kan orsaka akut toxicitet förmodligen genom oxidativ fosforylering unkoppling30. Nästa, den 1,4-benzenediol, kallas Hydrokinon, är en fenol förening som kan utlösa en icke-specifik och cytotoxiska immunsvar i fisk31. Slutligen, 4-hexylfenol har varit kända för att uppvisa tillräcklig positiv östrogena aktivitet klassificeras som en ED32. Det har varit väl studerat att den främsta orsaken till den akuta toxiciteten av hydrokinon är minskningen-oxidation (redox) cykling. Hydrokinon oxideras till benzoquinone och reduceras tillbaka till semi-quinone eller hydrokinon upprepade gånger, med nedbrytande kofaktorer och generera reaktiva syreradikaler33. De andra två kemikalierna kan kräva djupare undersökningar för att avslöja deras verkningsmekanismer vid akut ekotoxicitet med hjälp av molekylära docknings metoder som den som används av Panche et al.34, som inte kan TÄCKAS av QSAR-verktygslådan.
EDs störa det endokrina systemet främst genom fysikalisk-kemiska interaktioner med steroid receptorer såsom östrogen och androgenreceptorer, som är av stort intresse för QSAR modellering studier35. Med tanke på detta är QSAR Toolbox robust när det gäller facile och snabb klassificering av ER-bindande tillhörighet för en uppsättning kemikalier som endast bygger på 2D-beskrivare av molekylära strukturer. När detta ER profiler-system tillämpades på vår lista över hormonstörande ämnen hittades ingen tydlig korrelation mellan ER-bindningsaffinitet och hydrofobicitet (tilläggs figur S2). Detta resultat kan förklaras av det faktum att bildandet av en steroid-receptorn komplex är inte en direkt följd av en hydrofoba bindning bidrag utan bör åtföljas av en överensstämmande förändring i den aktiva-plats receptor struktur36. Receptor bandet kan vara också tack vare väten-bindning och π-stapla.
Dessutom kan positionen för varje kemisk grupp på molekylen påverka receptor bindningen, även om hydrofobicitet och antal väteobligatorer-givare förblir desamma. För det andra producerade ER profiler motsatta trender mellan predikterade och experimentella LC50 medel nivåer med ökande er-bindningsaffinitet (figur 5). Detta kan bero på att dödlighet hos föräldrarna i ett akut toxicitetstest inte beror på ER bindande utan snarare att narkos i de flesta fall, eller att Redox cykling i fråga om hydrokinon. Till exempel krävs en mer omfattande analys, inklusive kronisk toxicitet, för en större uppsättning EDs för att definiera förutsägande begränsningar i den aktuella versionen av QSAR-verktygslådan.
Denna preliminära forskning kan också ha folkhälso konsekvenser eftersom steroider (androgener, östrogener, progestines, och kortikoider) och deras receptorer uppvisar liknande eller ens identiska makromolekylära strukturer över ryggradsdjur5. Dessa typer av analoga endokrina signalering system kan fungera med hjälp av en gemensam mekanism i viktiga händelser av EDs5. Ytterligare och kompletterande metoder krävs dock för att belysa denna stora och komplexa aspekt [till exempel genom att utföra beräknings modellering av absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) och/eller negativa resultat väg (AOP)]38. Dessutom, eftersom de flesta av de vetenskapliga och offentliga farhågor om de negativa effekterna av EDs är relaterade till deras kroniska toxiciteter, förbättra databaser och algoritmer i QSAR Toolbox och producera tillförlitlig långsiktig ekotoxikologi förutsägelser för EDs är båda nödvändiga.
Denna uppsats visar tillämpningen av QSAR Toolbox för att jämföra ekotoxikologiska LC50 värden för fisk med log10Kow värden av EDs. under hela protokollet leder det till svaga relationer mellan de två parametrarna, avslöjats genom tidigare studier (t. ex. Kim et al.39) som log10Kow är inte en bra direkt prediktor för Aquatic LC50. Trots denna begränsning, ger detta protokoll en allmän översyn eller “Vignette” för att beskriva hur man använder instrumentpanelen för ett givet ändamål, eftersom det är ett giltigt program för att använda QSAR verktygslådan för att undersöka korrelationer mellan LC50 (eller er bindning (affinitet) och log 10 Kow, eller som ett verktyg för snabb undersökning av akut ekotoxicitet. Det bör dock noteras att (1) upplysande sambandet mellan östrogen receptorbindning och kronisk toxicitet, snarare än akut toxicitet (dödlighet), är mer relevant så att tydligare korrelationer kan hittas, och (2) androgenreceptorn, tillsammans med den av östrogen, spelar också en avgörande roll i reproduktionstoxicitet. Därför krävs för den framtida versionen av QSAR-verktygslådan för att förbättra förutsägelse funktioner mot bakgrund av dessa två punkter.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av det nationella forskningsrådet för Science & Technology (NST) Grant av den sydkoreanska regeringen (MSIP) (No. CAP-17-01-KIST Europe) och projekt 11911.
Adobe Acrobat Reader DC | Adobe Systems Software Ireland Limited | NA | Required to view prediction and category report |
Computer | System: Microsoft Corporation | NA | Recommended system properties: (i) system type: 64 bit, Microsoft Windows 7 or newer, (ii) processor: I5 at 2.4 GHz or faster processor or equivalent AMD CPU, (iii) Installed memory (RAM): 6 GB of RAM, (iv) Hard Disk Drive (HDD): 20 GB free hard drive space |
Microsoft Editor | Microsoft Corporation | NA | Required to upload a substance list of CAS numbers (batch mode) to the OECD QSAR Toolbox as .txt file (text file) |
Microsoft Excel 2016 | Microsoft Corporation | NA | Required to export data from OECD QSAR Toolbox as .cvs, .xls or .xlsx files |
OECD QSAR Toolbox version 4.0 or newer | Organisation for Economic Co-operation and Development |
NA | Required to run OECD QSAR Toolbox Automated Workflows; free download: https://qsartoolbox.org/download/ |
OriginPro 9 | OriginLab Corporation | NA | Optional program for data analysis; similar tools possible |