हम polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मानव अंडे परिपक्वता के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए नैदानिक प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा प्रदान करते हैं.
intracytoplasmic शुक्राणु इंजेक्शन (ICSI) का इष्टतम समय प्रजनन कार्यक्रमों के लिए एक गंभीर चिंता का विषय है क्योंकि असामयिक शुक्राणु प्रविष्टि अंडे के विकास क्षमता कम हो जाती है. प्रथम ध्रुवीय शरीर (पीबी) की उपस्थिति एक साथ meiotic धुरी के साथ अंडाणु परिपक्वता और निषेचन के लिए अंडे की तत्परता के पूरा होने का संकेत है. नैदानिक अभ्यास में, यह मान लेना प्रथागत है कि पंजाब को प्रदर्शित करने वाले सभी अंडाणु परिपक्व मेटाफेज (एमआईआई) ओसाइट्स हैं। हालांकि, पंजाब बाहर निकालना द्विध्रुवी MII धुरी के गठन से पहले. इस अतुल्यकाल पंजाब की मात्र उपस्थिति oocyte परिपक्वता के एक अविश्वसनीय मार्कर बनाता है. noninvasive धुरी इमेजिंग polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी (PLM) का उपयोग कर त्वरित और आसान निरीक्षण की अनुमति देता है कि क्या पंजाब प्रदर्शित oocyte वास्तव में ICSI से पहले एक meiotic धुरी reassembled. यहाँ, हम नैदानिक प्रयोगशाला में मानव अंडा परिपक्वता मूल्यांकन करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम यह भी बताते हैं कि ओसाइट के विकास के चरण के संबंध में आईसीएसआई के समय को कैसे अनुकूलित करें ताकि देर से-मटरिंग ऊसाइट्स के समय से पहले शुक्राणु इंजेक्शन को रोका जा सके। इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, यहां तक कि अपरिपक्व oocytes इन विट्रो में पंजाब extruding चिकित्सकीय उपयोग किया जा सकता है. पुष्टि है कि MII धुरी शुक्राणु इंजेक्शन और ICSI के समय के व्यक्तिगत समायोजन से पहले मौजूद है गरीब रोग का रोग इन-विट्रो निषेचन (IVF) चक्र में विशेष रूप से निषेचन के लिए उपलब्ध ocytes की एक कम संख्या के साथ महत्वपूर्ण है.
एक निषेचनीय अगुणित अंडा बनने के लिए, द्विगुणित अंडाणु को अपनी आनुवंशिक जानकारी का आधा आसन्न कोशिका में निकालना होता है, जिसे पहले ध्रुवीय शरीर (पीबी) कहा जाता है, और द्विध्रुवी मेटाफेज II (एमआईआई) धुरी के भूमध्य रेखा में गुणसूत्रों को संरेखित करना होता है। जबकि पंजाब स्पष्ट रूप से पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है, आनुवंशिक सामग्री और cytoskeletal संरचनाओं का पता लगाने आम तौर पर आक्रामक तैयारी प्रक्रियाओं है कि प्रजनन उपचार के लिए ocyte के आगे उपयोग के साथ असंगत हैं की आवश्यकता है. इसलिए, नैदानिक अभ्यास में, पंजाब की उपस्थिति को अंडाणु परिपक्वता की पहचान के रूप में माना जाता है। हालांकि, मानव अंडाणु परिपक्वता के दौरान microtubule और गुणसूत्र गतिशीलता के लाइव इमेजिंग से पता चला कि पंजाब द्विध्रुवी MII धुरी इकट्ठा किया जाता है और गुणसूत्रों गठबंधन कर रहे हैं1से पहले कुछ घंटे दिखाई देता है. फिर भी, संचारित प्रकाश में, MII गिरफ्तार अंडे ocytes जो सिर्फ गुणसूत्र अलगाव की प्रक्रिया में प्रवेश से अविवेच्य हैं. इस प्रकार, अंडाणुओं का एक सहगण, जिसे केवल पंजाब की उपस्थिति के आधार पर एमआईआई ओसाइट्स के रूप में वर्गीकृत किया गया है, में देर से ओसाइट्स हो सकते हैं जो अभी तक अपना विकास पूरा नहीं कर चुके हैं और इस प्रकार निषेचन के लिए तैयार नहीं हैं।
अंडाणु परिपक्वता की देरी से गरीब प्रतिक्रियाकर्ताओं की संख्या कम होने की संभावना है जिसमें एमआईआई ऊसाइटों की संख्या कम हो जाती है और उत्तेजित चक्र2में अप्रत्याशित रूप से अपरिपक्व अंडाणुओं का उच्च अनुपात होता है . विवो में, केवल एक एकल, सबसे अच्छी गुणवत्ता वाले अंडे परिपक्वता प्राप्त करता है और ovulated हो जाता है। इन-विट्रो निषेचन (आईवीएफ) चक्र में, नियंत्रित डिम्बग्रंथि hyperstimulation परिपक्वता के लिए कई अंडाणुओं की भर्ती करने के लिए प्रयोग किया जाता है। गोनाडोट्रोपिन वृद्धि से माइओटिक कार्यक्रम की बहाली शुरू हो जाती है और अंडे के जनक ों को 36 घंटेकेभीतर एमआईआई गिरफ्तारी चरण तक पहुंचने की अपेक्षा की जाती है . हालांकि, preovulatory follicles से प्राप्त अंडाणु अक्सर पीबीdisplaying MIi oocytes और अपरिपक्व oocytes के एक वर्गीकरण का गठन, या तो मेटाफेज मैं (एमआई) या germinal वेस्कल चरण (GV) (चित्र 1)। केवल एमआईआई ओसाइट्स इंट्रासाइटोप्लाज्मिक शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई) के अधीन हैं, जबकि अपरिपक्व अंडाणु आमतौर पर खारिज कर दिए जाते हैं। फिर भी, जब इन विट्रो में खेती की जाती है, तो एमआई ओसाइट्स आमतौर पर इन विट्रो में पंजाब को बाहर निकालने के लिए मनाया जाता है। उनकी सामान्य हीनता के बावजूद, देर से-मटरिंग oocytes जो सहज रात भर संस्कृति के दौरान पहली meiotic विभाजन पूरा सफलतापूर्वक पिछले संसाधन oocytes के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और जीवित जन्मों की सूचना दी गई है4,5 ,6,7,8. इसलिए, शुक्राणु का असामयिक इंजेक्शन एक प्राथमिक कारण हो सकता है जो पिछले अध्ययनों9,10,11में रिपोर्ट किए गए देर से-मटरिंग ओसाइट्स के खराब विकास ात्मक परिणामों के अंतर्निहित हो सकता है .
एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त Polarized प्रकाश माइक्रोस्कोपी (PLM) लाइव अंडाणु में meiotic धुरी के गैर इनवेसिव दृश्य के लिए अनुमति देता है. डबल प्रतिबिंब द्विध्रुवी धुरी के निर्माण microtubules के अत्यधिक आदेश विधानसभा के साथ polarized प्रकाश बीम की बातचीत से उत्पन्न होता है. चूंकि ध्रुवित प्रकाश सामान्य तीव्रता का है , इसलिए इस तकनीक का प्रयोग नैदानिक सेटिंग्स में विभाजन तंत्र11,12,13,14की गतिशीलता को देखने के लिए सुरक्षित रूप से किया जा सकता है . अंडाणु के भीतर एमआईआई तर्कु द्वि-प्रावरण की उपस्थिति की पहचान अंडे की विकास क्षमता9,15,16,17,18के मार्कर के रूप में की गई है, 19,20,21,22,23. इस प्रकार, यह सुझाव दिया गया है कि गैर इनवेसिव meiotic धुरी इमेजिंग नैदानिक अभ्यास में अंडे की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहै 11,14,20.
चूंकि अंडाणु अर्धसूत्री विषाणु के दौरान माइक्रोट्युबुलर गतिशीलता के लिए समय-सीमा1हल की गई है, इसलिए मनाया गया पीएलएम पैटर्न एमआई आई आई संक्रमण के समय पाठ्यक्रम से बेहतर हो सकता है। पंजाब उत्सर्जन के तुरंत बाद, नवजात MII धुरी पीएलएम द्वारा undetectable हो जाता है. हालांकि, अगर अंडाणुओं को संस्कृति में रखा जाता है, तो द्विध्रुवी एमआईआई धुरी9,10,11को फिर से इकट्ठा करने पर बाद में उभर सकता है। इस प्रकार, अंडाणुओं में एक पंजाब इन विट्रो में extruding, धुरी की अनुपस्थिति केवल अस्थायी एमआई से MII चरण के लिए देर से परिपक्व अंडाणु के शारीरिक संक्रमण के लिए इसी हो सकती है. यदि MII धुरी संकेत undetectable है, शुक्राणु इंजेक्शन एक बाद समय बिंदु MII धुरी गठन के लिए अतिरिक्त समय प्रदान करने के लिए आस्थगित किया जा सकता है. ICSI समय के PLM-सहायता प्राप्त अनुकूलन नैदानिक उपयोग किया जा करने के लिए देर से परिपक्व oocytes की संभावना को अधिकतम और गरीब रोग का रोग का पूर्वानुमान रोगियोंकेलिए एक फर्क 9 .
नीचे, हम मानव oocytes में गैर इनवेसिव धुरी इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए कैसे की एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि कैसे PLM देर से-मटरिंग oocytes के समय से पहले निषेचन के जोखिम से बचने के लिए नियोजित किया जा सकता है.
मानव अंडाणुओं में एसेंटरोसोमल मीयोटिक धुरी अत्यधिक गतिशील और एक नाजुक संरचना1है . उपऑप्टिमल परिस्थितियों के अंतर्गत माइक्रोट्युबल रेशों को शीघ्रतासे विबहुलक बना दिया जाता है और मीओटिक तर्कु 30 ,31,32,33को अलग कर देता है . इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि अंडाणु संस्कृति और माइक्रोमैनोमैनिट की स्थिति, अर्थात् तापमान और पीएच इष्टतम श्रेणी में हैं। तर्कु व्यवधान के जोखिम को कम करने के लिए, अंडाणुओं को तापमान-नियंत्रित वातावरण में रखा जाना चाहिए जिसमें ओसाइट मीडिया में 37 – 0.5 डिग्री सेल्सियस बनाए रखा जाना चाहिए। एक गर्म चरण से सुसज्जित माइक्रोस्कोप और माइक्रोइंजेक्शन सेटअप का उपयोग सख्ती से आवश्यक है। पी एच fluctulations से बचने के लिए इनक्यूबेटर के बाहर oocytes के साथ सभी हेरफेर HEPES/MOPS बफर मीडिया में किया जाना चाहिए। परिवेश की स्थिति में अत्यधिक अंडाणु सौंपने के संभावित प्रतिकूल प्रभावों से बचने के लिए, पीएलएम परीक्षा का कुल समय 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। अंडाणुओं को कांच के नीचे के पकवान पर प्लास्टिक के ढक्कन के साथ विश्लेषण करना पड़ता है क्योंकि बीम पथ में मानक प्लास्टिक की स्थिति छवि विश्लेषण को बाधित करती है। क्योंकि प्लास्टिक और कांच के नीचे व्यंजन अलग थर्मल विशेषताओं है, तापमान परीक्षा डिश में मध्यम से निपटने की बूंदों में सीधे जाँच की जानी चाहिए.
प्रयोगशाला शर्तों के अलावा, प्रक्रियात्मक मतभेद और ऑपरेटर के micromanipulation कौशल PLM परीक्षा सटीकता पर एक प्रभाव हो सकता है. केवल अत्यधिक इकट्ठे द्विध्रुवी धुरी noninvasively कल्पना की जा सकती है. प्रेक्षित संकेत धुरी के संरचनात्मक संगठन की डिग्री के समानुपाती होता है। नवजात, ध्रुवीय, ढीला या अव्यवस्थित तर्कु केवल धुंधली द्वि-परिवर्तन या कोई भी प्रदर्शित नहीं होती है (चित्र3 और चित्र4)। इसके अलावा, माइक्रोट्युबल सरणियों के साथ ध्रुवित प्रकाश का अपूर्ण संरेखण सुविकसित द्विध्रुवी तर्कु की वास्तविक उपस्थिति के बावजूद केवल एक पारदर्शी और अपरिभाषित द्वि-प्रवर्तकता का उत्पादन करता है (चित्र 4)। जब तक ठीक से उन्मुख, धुरी संकेत आसानी से याद किया जा सकता है और oocyte परिपक्वता misdiagnosed (पूरक वीडियो). इष्टतम धुरी इमेजिंग के लिए, अंडाणु को प्रत्येक अक्ष के चारों ओर ठीक से चालू किया जाना चाहिए। चूंकि आईपियों में द्वि-प्रवर्तन दिखाई नहीं देता है, इसलिए ऑपरेटर को अंडाणु के घूर्णन करते समय कंप्यूटर स्क्रीन देखना होता है। माइक्रोमैनुएशन और इन विट्रो परिपक्व अंडाणुओं में अधिशेष में धुरी इमेजिंग के प्रशिक्षण के साथ पिछला अनुभव नैदानिक आवेदन करने के लिए स्विच करने से पहले वांछनीय है।
धुरी के अलावा, अंडाणु, ओलेमा, जोना पेलुसिडा की भीतरी परत और कुछ कोशिकाद्रव्यी संरचनाओं (उदा., रिफ्रैकटाइल निकायों, धानी) के आसपास की कम्युलस कोशिकाएं द्वि-परिवर्तन प्रदर्शित करती हैं (चित्र 5क-डी)। जब तक अच्छी तरह से इमेजिंग से पहले अंडाणु से हटा दिया, कसकर संलग्न कूपिक कोशिकाओं पृष्ठभूमि शोर का उत्पादन और meiotic धुरी का पता लगाने समझौता. धुरी के लिए एक बड़े रिफ्रैकटाइल शरीर की गलती न करें। कोशिकाद्रव्य में रहने वाले कई कोशिकाद्रव्यी समावेशन उच्च चमक प्रदर्शित करते हैं जो अंधेरे पृष्ठभूमि के साथ तेजी से विपरीत होता है। Meiotic धुरी, दूसरी ओर, केवल मध्यम संकेत प्रदर्शन, धुंधली सीमाओं और आम तौर पर नीचे या पहले पंजाब के बगल में oolema को देता है. कभी कभी, PLM परीक्षा अपनी मानक स्थिति से एक सकल धुरी विचलन का पता चलता है (चित्र 5E, एफ). यदि विभाजन तंत्र और पंजाब के बीच एक बड़ा कुसंरेखन है, तो पीएलएम माइक्रोइंजेक्शन के दौरान धुरी चोट के जोखिम से बचने के लिए अंडाणु को उन्मुख करने में मदद करता है। अंडाणु के भीतर धुरी की सापेक्ष स्थिति परिणामी भ्रूणों की विकासात्मकक्षमता को प्रभावित करती प्रतीत नहीं होती. हालांकि, जब धुरी को ओलेमा से प्रतिस्पर्धा होती है, तो निषेचन असामान्यताएं होती हैं। दिलचस्प बात यह है कि कुछ खराब गुणवत्ता वाले ऊसाइटों को माइक्रोट्युबल न्यूक्लिएशन शुरू करने के बजाय पीबी एक्सट्रूज़न के तुरंत बाद क्रोमैटिन विसंघन से गुजरना पड़ता है (चित्र 4 एफ)। ओसाइट परिपक्वता के केवल मार्कर के रूप में पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी और पंजाब का उपयोग करना, ऐसे उप-सक्षम अंडाणुओं को निषेचित माना जाएगा। इस प्रकार, नियमित रूपात्मक मूल्यांकन के शीर्ष पर, धुरी इमेजिंग अंडे की परिपक्वता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी जोड़ता है और इसकी गुणवत्ता के एक अप्रत्यक्ष मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं।
तर्कुदार एमआईआई ओसाइट्स की घटना अध्ययन जनसंख्या (उदा., आनुवंशिक पृष्ठभूमि, चिकित्सा स्थिति, मातृ आयु) की विशेषताओं से प्रभावित होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, सहगण के भीतर विकास की देरी वाले अंडाणुओं का अनुपात पता लगाए गए तर्कु-नकारात्मक अंडाणुओं की वास्तविक संख्या9,27को प्रभावित करेगा। Meiotic धुरी दृश्य यह स्पष्ट रूप से MII चरण में गिरफ्तार निषेचनीय ocytes की पहचान करने के लिए संभव बनाता है. इसके अलावा, बाद के समय में दूसरी जांच से यह पता चल सकता है कि धुरी-नकारात्मक अंडाणु असामान्य है या हाल ही में एमआई/एमआईआई संक्रमण9,10,11के माध्यम से प्रगति की है। जब आईसीएसआई से पहले एक धुरी विकसित करने की अनुमति दी जाती है, यहां तक कि अपरिपक्व अंडाणु, जो नियमित रूप से खारिज कर दिए जाते हैं, व्यवहार्य भ्रूण9का उत्पादन कर सकते हैं। निषेचन के लिए उपलब्ध बहुत कुछ oocytes के साथ चक्र में, ठीक से समय पर ICSI oocytes extruding पंजाब एक बचाव रणनीति और चक्र रद्द करने के लिए विकल्प के रूप में सेवा कर सकते हैं.
फिर भी, preincubation समय का विस्तार सभी oocytes के लिए सामान्यीकृत नहीं किया जाना चाहिए. सामान्य प्रतिक्रिया देने वालों से विवो परिपक्व अंडाणु ओंकारमें आम तौर पर एमआईआई धुरी9,20,21,27प्रदर्शित होती है . यहाँ, सफल धुरी इमेजिंग की संभावना इन विट्रो उम्र बढ़ने35में पोस्ट-ओवुलेटरी का एक परिणाम के रूप में समय के साथ कम हो जाती है। यदि संभव हो तो आईसीएसआई को पुनर्प्राप्ति के दिन किया जाना चाहिए और यह 9 घंटे (45 घंटे बाद एचसीजी) से अधिक नहीं होना चाहिए, परिणामस्वरूप भ्रूण की गुणवत्ता में गिरावट के साथ संबद्ध अवधि36,37. अलग द्विध्रुवी धुरी प्रदर्शित Oocytes आगे देरी के बिना आईसीएसआई के अधीन किया जाना चाहिए. संक्षेप में, आईसीएसआई समय के व्यक्तिगत अनुकूलन समय से पहले शुक्राणु इंजेक्शन के किसी भी जोखिम को बाहर करने के लिए गरीब रोग रोगियों में सार्थक है। हालांकि, यह अनावश्यक है, भी समय लेने वाली और सभी आईवीएफ चक्र में प्रदर्शन किया जा करने के लिए कठिन.
पीएलएम विश्लेषण से पता चलता है कि क्या अंडाणु एमआईआई चरण तक पहुंच गया। हालांकि, meiotic धुरी के noninvasive दृश्य गुणसूत्र संगठन के बारे में कोई जानकारी प्रदान करता है. वहाँ गंभीर गुणसूत्र misalignment हो सकता है और / या मातृ उम्र से संबंधित क्रोमेटिड एक द्विध्रुवी धुरी की विशेषता oocytes में विभाजित (चित्र 5) . विभिन्न अन्य कारकों प्रजनन सफलता पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है (जैसे, शुक्राणु कारक, mitochondria, भ्रूण जीनोम सक्रियण, अनियमित दरार, epigenetics, एंडोमेट्रियम, मातृ प्रतिरक्षा). इसलिए, से प्रति MII धुरी का पता लगाने, आईवीएफ प्रक्रिया के एक सकारात्मक नैदानिक परिणाम की गारंटी नहीं है.
The authors have nothing to disclose.
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Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |