Questo protocollo descrive un metodo di purificazione per la proteina ricombinante di legame del calcio senza tag S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli ioni per i saggi di stimolazione monocite umana.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Purificazione di Human S100A12 e delle sue Oligomeri indotte dallo ione per la stimolazione cellulare immunitaria
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo protocollo, descriviamo un metodo per purificare la proteina che lega il calcio umano S100A12 e i suoi oligomeri indotti dagli oligomeri di Escherichia coli per la stimolazione delle cellule immunitarie. Questo protocollo si basa su una strategia di cromatografia in due fasi, che comprende la pre-purificazione delle proteine su una colonna di cromatografia di scambio di anioni e un successivo passo di lucidatura su una colonna di interazione idrofobica. Questa strategia produce proteine S100A12 ad alta purezza e resa a costi gestibili. Per i test funzionali sulle cellule immunitarie l'eventuale contaminazione da endotossina residua richiede un attento monitoraggio e ulteriori passaggi di pulizia per ottenere proteine prive di endotossina. La maggior parte delle contaminazioni da endotossina può essere esclusa dalla cromatografia di scambio di anioni. Per esaurire le contaminazioni residue, questo protocollo descrive una fase di rimozione con filtri centrifughi. A seconda della forza io-resistenza disponibile S100A12 può organizzare in diversi omomultimer. Per studiare il rapporto tra struttura e funzione, questo protocollo descrive ulteriormente il trattamento io-io della proteina S100A12 seguito dal crosslinking chimico per stabilizzare gli oligomeri S100A12 e la loro successiva separazione per dimensione-esclusione Cromatografia. Infine, descriviamo un saggio basato sulle cellule che conferma l'attività biologica della proteina purificata e conferma la preparazione senza LPS.
Introduzione
S100A12 è una proteina legante di calcio che è prevalentemente prodotta da granulociti umani. La proteina è sovraespressa durante l'infiammazione (sistemica) e i suoi livelli di siero, in particolare nelle malattie (auto)infiammatorie come l'artrite idiopatica giovanile sistemica (sJIA), la febbre mediterranea familiare (FMF) o la malattia di Kawasaki (KD) l'attività della malattia e la risposta alla terapia. A seconda dei recettori di riconoscimento dei modelli (PRR), come i recettori a pedaggio (TLR), il sistema immunitario innato può essere attivato da modelli molecolari associati a i patogeni (PPR) come lipopolioaccharides (LPS) o modelli molecolari associati al d....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOT: Si prega di fare riferimento alla tabella supplementare 1 per la preparazione di buffer e soluzioni di stock.
1. Espressione proteica in E. coli
-
Clonazione
- Clona l'uomo s100A12 (ncBI Reference Sequence: NP_005612.1) in un vettore di espressione batterica pET11b. Per esprimere la proteina, trasformare il costrutto in E. coli BL21(DE3).
-
cultura
- Preparare una coltura di avviamento inoculando una singola colonia in 5 mL di mezzo di crescita (brodo LB con 100 ampicillina g/mL) in un tubo rotond....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In seguito alla pre-purificazione sulla colonna AIEX (Figura 1A-C) e al successivo HIC dipendente dal calcio (Figura 2A,B), sono state ottenute proteine altamente pure (Figura 2C). Inoltre, le misurazioni dell'endotossina hanno rivelato un successo della rimozione degli LPS. Il contenuto LPS seguito all'AIEX è stato misurato in una diluizione 1:10 superiore al limite di rilevamento degli saggi, vale.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo protocollo, descriviamo l'espressione batterica priva di tag dell'uomo S100A12 e la sua purificazione, nonché la separazione in diversi oligomeri indotti dagli ioni per la stimolazione delle cellule immunitarie. Rispetto alla letteratura pubblicata sulla purificazione della proteina S100A128,23,24, l'uso dell'alto CaCl2 (25 mM) nella cromatografia di interazione idrofobica è a nostra conoscenza unica. Divers.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del programma di ricerca medica innovativo intramurale della facoltà di medicina dell'Università Muenster (da KE121201 a C.K.) e della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, Fo354/3-1 a D.F.).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| pET11b vettore | Novagen | ||
| BL21(DE3) competente E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Aminoacidi non essenziali | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4− 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillina sale sodico | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Cloruro di calcio Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Soluzione decolorante | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Soluzione colorante | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani | Stemcell | 19059 | Kit di isolamento cellulare magnetico negativo |
| EDTA sale disodico diidrato | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Rilevamento di endotossine saggio |
| Acqua ultrapura senza endotossine | Sigma-Aldrich | TMS-011-A Acqua | ultrapura per la preparazione di tamponi privi di endotossine |
| EndoTrap rosso | Hyglos | 321063 | Resina per la rimozione delle endotossine |
| FBS (inattivata termicamente) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, senza calcio, senza magnesio | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (alta qualità, testetto di endotossine) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alfa - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropil-szlig;-D-tiogalattopiranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutammina (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolisaccaridi da E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, umano | PAN Biotech | P04-60500 | Soluzione di separazione (centrifugazione a gradiente di densità) |
| Penicillina/Streptomicina (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Fenil Sefarosio ad alte prestazioni | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resina per cromatografia di interazione idrofobica |
| Polimixina B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Compresse di inibitori della proteasi | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resina per cromatografia a scambio anionico |
| Tampone RoboSep | Stemcell | 20104 | Tampone di separazione cellulare (sezione 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Idrossido di sodio | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Cloruro di zinco | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µ m filtro per siringa | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL provette a fondo tondo | BD | 352059 | |
| 2 L Pallone Erlenmyer | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 pozzetti piastre di sospensione | Greiner | 662102 | |
| 5 L misurino | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL provette da centrifuga coniche | Corning | 430829 | |
| Provette da centrifuga ad alta velocità da 50 mL | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDa Unità | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa Merck | UFC905024 | ||
| Piatto di coltura (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Chiusure per tubi per dialisi | Spettro | 132738 | |
| Magnete EasySep 'The Big Easy'Stemcell | 18001 | ||
| Provette per collettore di frazioni 5 mL | Greiner | 115101 | |
| pellicola Lumox, 25 &; micro; m, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film per piastre di coltura di monociti |
| Membrana per dialisi Spectra/Por (3,5 kDa)Unità filtrante Spectra/Por | 132724 | Spectrum | |
| Merck | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 ° C Incubatore (con agitazione) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| Ä Purificatore KTA UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Raccoglitore di frazioni | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuga (con rotore A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Rotore ad angolo fisso | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicatore | Brandelin | UW2070 | |
| Lettore di fluorescenza | Tecan | M200PRO | |
| pHmetro | Knick | 765 |
Riferimenti
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
