Этот протокол описывает метод очистки для рекомбинантных тегов без кальция связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для человека моноцитов стимуляции анализов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очистка человека S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров для стимуляции иммунных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом протоколе мы описываем метод очистки человека кальций-связывающий белок S100A12 и его ион-индуцированных олигомеров из культуры escherichia coli для стимуляции иммунных клеток. Этот протокол основан на двухступенчатой стратегии хроматографии, которая включает в себя предочищение белка на колонке хроматографии анион-обменификации и последующий полировка шага на колонке гидрофобного взаимодействия. Эта стратегия производит белок S100A12 высокой чистоты и урожайности при управляемых затратах. Для функциональных анализов на иммунных клетках возможное пережитеевое эндотоксинное загрязнение требует тщательного мониторинга и дальнейших мер по очистке для получения белка без эндотоксина. Большинство эндотоксинных загрязнений могут быть исключены с помощью анион-обменной хроматографии. Для истощения остаточного загрязнения в этом протоколе описывается шаг удаления центробежных фильтров. В зависимости от доступных ионно-силовых S100A12 может организовать в различных homomultimers. Для изучения взаимосвязи между структурой и функцией, этот протокол далее описывает ионную обработку белка S100A12 с последующим химическим перекрестным соединением для стабилизации олигомеров S100A12 и их последующего разделения путем исключения размера Хроматографии. Наконец, мы описываем анализ на основе клеток, который подтверждает биологическую активность очищенного белка и подтверждает препарат без LPS.
Введение
S100A12 является кальциевый связывающий белок, который в основном производится человеческими гранулоцитами. Белок переэкспрессирован во время (системного) воспаления и его уровня сыворотки, особенно при (авто) воспалительных заболеваниях, таких как системный ювенильный идиопатический артрит (sJIA), семейная средиземноморская лихорадка (FMF) или болезнь Кавасаки (KD) может сообщить о активности заболевания и реакции на терапию. В зависимости от рецепторов распознавания образов (PRRs), таких как платные рецепторы (TLRs), врожденная иммунная система может быть активирована патогенно-ассоциированными молекулярными моделями (PAMP), такими как липополисахариды (LPS) или пов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к дополнительной таблице 1 для подготовки буферов и фондовых решений.
1. Выражение белка в кишечной палочке
-
Клонирование
- Клон тегов без человека S100A12 (NCBI Справочная последовательность: NP-005612.1) в бактериальной экспрессии вектор pET11b. Чтобы выразить белок, преобразуйте конструкцию в E. coli BL21 (DE3).
-
Культуры
- Подготовьте стартер культуры путем прививки одной колонии в 5 мл среды роста (LB бульон с 100 мкг /мл ампициллин) в 14 мл круглого дна трубки. Инкуби....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После предварительной очистки на колонке AIEX(Рисунок 1A-C) и последующих кальциевых зависимых HIC (Рисунок 2A,B), очень чистый белок был получен(рисунок 2C). Кроме того, измерения эндотоксина показали успешное удаление ЛПС. Содержание LPS после AIEX измерялось в 1:10 разбавления выше предела обнаружения ассеа, т.е. выше 500 EU/mL. После первой фильтрации через фильтр 50 kDa, содержание LPS было уме.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе мы описываем безметиваемую бактериальную экспрессию человека S100A12 и его очищение, а также разделение на различные ионные олигомеры для стимуляции иммунных клеток. По сравнению с опубликованной литературой по очистке белка S100A128,23,24, использование высокого CaCl2 (25 мМ) в гидрофобно-взаимодействии хроматографии, насколько нам известно, уникальным. Несколько протоколов, применяющих концентрации .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами от интрамуральной инновационной медицинской исследовательской программы медицинского факультета Университета Мюнстера (KE121201 до C.K.) и Немецкого исследовательского фонда (DFG, Fo354/3-1 до D.F.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| pET11b вектор Novagen | |||
| BL21(DE3) компетентный E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| <сильный> | |||
| >100x Заменимые аминокислоты | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4− 20% Мини-ПРОТЕАН TGX Протеиновые гели | BioRad | 4561093 | |
| ампициллина натриевая соль | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (бис(сульфосукцинимидил)суберат) - 50 мг | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Дигидрат хлорида кальция | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Раствор для удаления пятен | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Окрашивающий раствор | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Набор для обогащения моноцитов человека | Стволовые клетки | 19059 | Набор для выделения магнитных отрицательных клеток |
| EDTA дигидрат динатриевой соли | Карл Рот | 8043.1 | |
| EGTA | Карл Рот | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Обнаружение эндотоксинов |
| анализ Ультра чистая вода без эндотоксинов | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ультрачистая вода для приготовления буферов без эндотоксинов |
| EndoTrap красный | Hyglos | 321063 | Смола для удаления эндотоксинов |
| FBS (термоинактивированная) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, без кальция, без магния | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (высокое качество, эндотоксин testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (изопропил-ß-D-тиогалактопиранизид) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-глутамин (200 мМ) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Липополисахариды из E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Разделительный раствор (центрифугирование с градиентом плотности) |
| Пенициллин/стрептомицин (10.000 Ед/мл) | Merck | A 2212 | |
| Фенилсефароза Высокая производительность | GE Healthcare | 17-1082-01 | Смола для гидрофобное взаимодействие хроматография |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Таблетки ингибитора протеазы | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Смола для аниообменной хроматографии |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Буфер для разделения клеток (раздел 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck F 1215 | ||
| Хлорид натрия (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Гидроксид натрия | Carl Roth | P031.1 | |
| Трис База | Carl Roth | 4855.3 | |
| Хлорид цинка | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 & микро; m шприц фильтр | Merck | SLHA033SS | |
| 14 мл круглодонные трубки | BD | 352059 | |
| 2 л колба Erlenmyer | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 луночные подвесные пластины | Greiner | 662102 | |
| 5 л мерный стакан | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 мл конические центрифужные пробирки | Corning | 430829 | |
| Высокоскоростные центрифужные пробирки объемом 50 мл | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15 MWCO 3 кДа | Merck | UFC900324 | |
| Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15 MWCO 50 кДа | Merck | UFC905024 | |
| чашка для культур (100 мм) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Закрытие диализных трубок | Спектр | 132738 | |
| EasySep магнит 'The Big Easy'Stemcell | 18001 | ||
| Фракционные коллекторные пробирки 5 мл | Greiner | 115101 | |
| пленка Lumox, 25 &; m, 305 мм x 40 м | Sarstedt | 94,60,77,316 | Пленка для моноцитарных культуральных планшетов |
| Spectra/Por Диализная мембрана (3,5 кДа) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop фильтрующая установка | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 ° C Инкубатор (с встряхиванием) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| Ä Очиститель KTA UPC 10 | Система FPLC | GE Healthcare | |
| Сборник фракций | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Центрифуга (с ротором A-4-81) | Eppendorf | 5810R Ротор | |
| фиксированным углом наклона | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Ультразвуковой аппарат | Brandelin | UW2070 | |
| Флуоресцентный считыватель | Tecan | бесконечная M200PRO | |
| pH-метр | Knick | 765 |
Ссылки
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phago....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
