在人类多能干细胞中使用CRISPR-CAS9生成定义的基因组修饰
Summary
该协议提供了一种方法，促进在人类多能干细胞中使用CRISPR-CAS9生成定义的异质核苷酸或同源核苷酸变化。
Abstract
人类多能干细胞为研究基因功能和模拟与疾病相关的特定突变提供了强大的系统。由于CRISPR-CAS9介导在第二个等位基因的形成，精确异构基因修饰的生成具有挑战性。在这里，我们演示了一个协议，以帮助克服这一困难，通过使用两个修复模板，其中只有一个表示所需的序列变化，而两个模板包含无声突变，以防止重新切割和indel形成。该方法对DNA的基因编辑编码区域产生异源对照和突变人类干细胞系，研究人类疾病和生物学最为有利。此外，还优化了转染和筛选方法，以减少基因编辑实验的人工和成本。总体而言，该方案广泛适用于利用人类多能干细胞模型进行的许多基因组编辑项目。
Introduction
人类胚胎干细胞 （hESCs） 和诱导多能干细胞 （iPSC） 是模拟人类疾病的宝贵工具，因为它们具有更新能力，同时保持生成不同谱系细胞类型的能力1，2 ，3，4.这些模型开启了询问基因功能的可能性，并了解特定突变和表型如何与各种疾病5、6相关。然而，为了理解特定改变如何与特定的表型相关联，使用成对同源对照和突变细胞系对于控制线变异性7、8非常重要。转录活化剂样效应素核酸酶（TALEN）和锌指核酸酶已用于在各种基因模型（包括原发细胞）中生成插入或删除（indels）突变;但这些核酸酶可能使用繁琐，而且价格昂贵9，10，11，12，13，14。集群定期间隔短节重复（CRISPR）-CAS9核酸酶的发现，由于在基因组的几乎任何区域的印德尔形成效率、使用简单性以及成本降低15，使该领域发生了革命性的变化。,16,17,18,19.
使用CRISPR-CAS9基于基因组编辑技术的挑战是生成或校正一个等位基因的特定突变，而不在第二个等位基因20中产生indel突变。该协议的主要目标是通过使用两个单链寡核苷酸 （ssODN） 修复模板来克服这一挑战，以减少第二个等位基因的形成。两种ssODN都设计包含无声突变，以防止CAS9核酸酶的重新切割，但只有一个包含利息的改变。该方法提高了产生特定杂性基因修饰的效率，而不会在第二个等位基因中诱导indel形成。利用该协议，在六个独立基因组位置进行基因编辑实验，证明在一个等位基因中精确引入所需的基因组变化，而第二个等位基因形成无indel形成，总效率为±10%。所述议定书改编自马奎尔等人21日。
Protocol
1. 导引RNA（gRNA）的设计和结构
注：每个gRNA由两个60基对（bp）寡核苷酸组成，这些基质退火产生100 bp双绞合（ds）寡核苷酸（图1A-C）。gRNA 设计、生成和测试切割效率的时间表约为 2 周（图 2）。
- 选择要编辑基因组的DNA区域，并确定符合格式的3-4 23 bp序列，5′-G（N 19）NGG-3’。这些序列应位于感兴趣区域?…
Representative Results
生成 gRNA 和针对印子的筛查
每个gRNA将被克隆成质粒载体，并使用U6启动子表达。AflII限制酶用于使质粒（添加基因#41824）线性化，位于 U6 启动子之后。两个 60 bp 寡核糖退火后产生的 100 bp 波段使用 DNA 程序集克隆到 gRNA 表达载体中。一旦gRNA质粒生成，它们与CRISPS-CAS9 GFP质粒（添加基因#44719）一起转染成hESC或iPSC。GFP® 细胞在2天后进行分拣，以丰富转染细胞…
Discussion
在此协议中，CRISPR-CAS9 与两个ssODN修复模板一起，在人类多能干细胞中证明具有特定的异构基因组变化或同源基因组变化。该方法成功地生成了异源细胞系，以接近10%的效率表达异质基因组变化。该协议已针对人类ESC和iPSCs在辐照MEF上生长，支持细胞生长和存活后培养细胞在低密度细胞排序后。通过维持具有10纳克/mL bFGF和Y-27632二盐的细胞，可以最大限度地减少细胞死亡。该协议可能适用于馈送自?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）、国家卫生研究院的资助，资助了U01HL099656（P.G.和D.L.F.）和U01HL134696（P.G.和D.L.F.）。
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
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