Generering av definierade genomiska modifikationer med CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller
Summary
Detta protokoll ger en metod för att underlätta generering av definierade heterozygot eller homozygot nukleotidförändringar med hjälp av CRISPR-CAS9 i humana pluripotenta stamceller.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller erbjuder ett kraftfullt system för att studera genfunktion och modellspecifika mutationer relevanta för sjukdom. Generationen av exakta heterozygot genetiska modifikationer är utmanande på grund av CRISPR-CAS9 medierad indel formation i den andra allelen. Här demonstrerar vi ett protokoll för att hjälpa till att övervinna denna svårighet genom att använda två reparationsmallar där endast en uttrycker önskad sekvens förändring, medan båda mallarna innehåller tysta mutationer för att förhindra omskärning och indel formation. Denna metod är mest fördelaktig för genredigering kodnings regioner av DNA för att generera ISOGEN kontroll och muterade mänskliga stamcellslinjer för att studera mänskliga sjukdomar och biologi. Dessutom har optimering av transfektion och screeningmetoder utförts för att minska arbete och kostnader för ett genredigering experiment. Sammantaget är detta protokoll allmänt tillämpligt på många genom redigering projekt som utnyttjar den mänskliga pluripotenta stamcells modellen.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs) är värdefulla verktyg för modellering av mänskliga sjukdomar på grund av deras förmåga till förnyelse, samtidigt som förmågan att generera celltyper av olika härstamningar1,2 ,3,4. Dessa modeller öppnar möjligheten att förhöra genfunktion, och förstå hur specifika mutationer och fenotyper är relaterade till olika sjukdomar5,6. För att förstå hur en specifik förändring är kopplad till en viss fenotyp är dock användningen av en parkopplad ISOGEN kontroll och muterade cellinjer viktig för att kontrollera linje-till-linjevariationen7,8. Transkription Activator-liknande effektor nukleaser (talens) och zink finger nukleaser har använts för att generera insättning eller radering (indels) mutationer i olika genetiska modeller, inklusive primära celler; men dessa nukleaser kan vara besvärligt att använda och dyra9,10,11,12,13,14. Upptäckten av den grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom REPEAT (CRISPR)-CAS9 Nuclease har revolutionerat området på grund av effektivitet i indel formation i praktiskt taget alla regioner i arvsmassan, enkelhet i användning, och minskning av kostnaderna15 , 16 , 17 , 18 , 19.
En utmaning i att använda den CRISPR-CAS9 baserade genom-redigeringsteknik har varit generering eller korrigering av specifika mutationer i en allel utan att skapa en indel-mutation i den andra allelen20. Det stora målet med detta protokoll är att övervinna denna utmaning genom att använda två enkelsträngade oligonukleotid (ssODN) reparationsmallar för att minska indel formation i den andra allelen. Båda ssODNs är utformade för att innehålla tysta mutationer för att förhindra omskärning av CAS9 Nuclease, men bara en innehåller förändringen av intresse. Denna metod ökar effektiviteten av att generera en specifik heterozygot genetisk modifiering utan att inducera indel formation i den andra allelen. Med hjälp av detta protokoll, genredigering experiment i sex oberoende genomisk platser visar exakt införandet av önskad genomisk förändring i en allel utan indel formation i den andra allelen och sker med en totalverkningsgrad på ~ 10%. Det beskrivna protokollet har anpassats från Maguire et al.21.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, användning av CRISPR-CAS9 tillsammans med två ssODN reparationsmallar för att generera specifika heterozygot eller homozygot genom förändringar påvisas i humana pluripotenta stamceller. Denna metod resulterade i en lyckad generering av isogena cellinjer som uttrycker heterozygot genomiska förändringar med en verkningsgrad nära 10%. Detta protokoll har optimerats för både mänskliga ESCs och iPSCs som odlas på bestrålade MEFs som stöder celltillväxt och överlevnad efter odling av celler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av finansiering från National Heart, lung, och blod Institute (NHLBI), National Institutes of Health genom bidrag U01HL099656 (P.G. och D.L.F.) och U01HL134696 (P.G. och D.L.F.).
Materials
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
- Srivastava, D., Dewitt, N. Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation. Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).
- Clevers, H. Review Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), 1-6 (2018).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).
- Tiyaboonchai, A., et al. GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells. Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).
- Guo, M., et al. Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E. Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Wang, Y., et al. Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging. Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).
- Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).
- Huang, X., et al. Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
- Wang, X., et al. Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).
- Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models. Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
- Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. Genome editing in human stem cells. Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).
- Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).
- Hou, Z., et al. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).
- Cong, L., Zhang, F. Genome engineering using CRISPR-Cas9 system. Methods in Molecular Biology. 1239, 197-217 (2015).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64 (2019).
