Denne protokollen gir en metode for å forenkle generering av definerte heterozygot eller homozygote nukleotid endringer ved hjelp av CRISPR-CAS9 i menneskelige Pluripotent stamceller.
Humane Pluripotent stamceller tilbyr et kraftig system for å studere gen funksjon og modellspesifikke mutasjoner som er relevante for sykdommen. Generering av presise heterozygot genetiske modifikasjoner er utfordrende på grunn av CRISPR-CAS9 mediert indel formasjon i den andre allel. Her demonstrerer vi en protokoll for å bidra til å overkomme dette problemet ved å bruke to reparasjons maler der bare én uttrykker ønsket sekvens endring, mens begge malene inneholder stille mutasjoner for å forhindre ny skjæring og indel dannelse. Denne metodikken er mest fordelaktig for genredigering koding regioner av DNA for å generere isogenic kontroll og mutant menneskelig stilk cellen linjer for å studere menneskelig sykdom og biologi. I tillegg har optimalisering av transfeksjoner-og screening-metoder blitt utført for å redusere arbeidskraft og kostnader for et gen redigerings eksperiment. Samlet sett er denne protokollen allment aktuelt for mange Genova redigering prosjekter utnytte den menneskelige pluripotent stilk cellen modell.
Human embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) er verdifulle verktøy for modellering menneskelig sykdom på grunn av deres kapasitet for fornyelse, og samtidig opprettholde muligheten til å generere celletyper av forskjellige linjene1,2 ,3,4. Disse modellene åpner muligheten for å forhøre genet funksjon, og forstå hvordan spesifikke mutasjoner og fenotyper er knyttet til ulike sykdommer5,6. Men for å forstå hvordan en bestemt endring er knyttet til en bestemt fenotype, er bruken av en sammenkoblet isogenic kontroll og mutant cellelinjer viktig for å kontrollere for linje til linje variasjon7,8. Transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs) og sink finger nukleaser har blitt brukt til å generere innsetting eller sletting (indeler) mutasjoner i ulike genetiske modeller, inkludert primær celler; men disse nukleaser kan være tungvint å bruke og dyre9,10,11,12,13,14. Oppdagelsen av gruppert regelmessig oppdelt kort palindromic gjenta (CRISPR)-CAS9 nuklease har revolusjonert feltet på grunn av effektivitet i indel formasjon i nesten hvilken som helst region av Genova, enkelhet i bruk, og reduksjon i kostnader15 , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19i denne.
En utfordring i å bruke CRISPR-CAS9 baserte Genova redigerings teknologi har vært generering eller korrigering av spesifikke mutasjoner i en allel uten å skape en indel mutasjon i den andre allel20. Hovedmålet med denne protokollen er å overvinne denne utfordringen ved å bruke to enkelt-strandet oligonukleotid (ssODN) reparasjon maler for å redusere indel formasjon i den andre allel. Begge ssODNs er designet for å inneholde tause mutasjoner for å hindre re-skjæring av CAS9 nuklease, men bare en inneholder endring av interesse. Denne metoden øker effektiviteten ved å generere en bestemt heterozygot genetisk modifisering uten å indusere indel formasjon i den andre allel. Ved hjelp av denne protokollen, genredigering eksperimenter i seks uavhengige genomisk steder demonstrere presis innføring av ønsket genomisk endring i en allel uten indel formasjon i andre allel og oppstår med en generell virkningsgrad på ~ 10%. Den beskrevne protokollen er tilpasset fra Maguire et al.21.
I denne protokollen, bruk av CRISPR-CAS9 sammen med to ssODN reparasjon maler for å generere spesifikke heterozygot eller homozygote Genova endringer er demonstrert i humant Pluripotent stamceller. Denne metoden resulterte i en vellykket generasjon av isogenic cellelinjer uttrykker heterozygot genomisk endringer med en virkningsgrad nær 10%. Denne protokollen er optimalisert for både menneskelige ESCs og iPSCs vokst på bestrålt MEFs som støtter cellevekst og overlevelse etter dyrking celler ved lav tetthet etter ce…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av finansiering fra National Heart, Lung, og Blood Institute (NHLBI), National Institutes of Health gjennom tilskudd U01HL099656 (P.G. and D.L.F.) og U01HL134696 (P.G. and D.L.F.).
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
Agarose | VWR | N605 | |
DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
dNTPs | Roche | 11969064001 | |
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
Orbital shaking incubator | |||
pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |