एक microtome का उपयोग कर एक बहुमुखी cryoslicing बीएन-एमएस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प complexome रूपरेखा के लिए प्रस्तुत किया है.
प्रोटीन आम तौर पर अन्य प्रोटीन के साथ बातचीत के माध्यम से जैविक कार्यों को लागू, या तो गतिशील प्रोटीन विधानसभाओं में या stably गठन परिसरों के एक भाग के रूप में. बाद सुंदर ढंग से देशी polyacrylamide जेल electrophoresis (बीएन-पेज) का उपयोग कर आणविक आकार के अनुसार हल किया जा सकता है। संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए इस तरह के जुदाई के युग्मन (BN-MS) अच्छी तरह से स्थापित किया गया है और सैद्धांतिक रूप से जैविक नमूनों में निकालने योग्य complexome के संपूर्ण मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, इस दृष्टिकोण बल्कि कठिन है और सीमित जटिल आकार संकल्प और संवेदनशीलता प्रदान करता है. इसके अलावा, इसके आवेदन प्रचुर मात्रा में mitochondrial और प्लास्टिड प्रोटीन के लिए प्रतिबंधित बनी हुई है. इस प्रकार, प्रोटीन के बहुमत के लिए, स्थिर प्रोटीन परिसरों में एकीकरण के बारे में जानकारी अभी भी कमी है. यहाँ प्रस्तुत जटिल रूपरेखा के लिए एक अनुकूलित दृष्टिकोण है जिसमें तैयारी-स्केल BN-PAGE जुदाई, क्रायोमाइक्रोटोम स्लिंग द्वारा व्यापक जेल लेन के उप-मिलीमीटर नमूना, और लेबल-मुक्त प्रोटीन परिमाणीकरण के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण शामिल है। कार्यविधियाँ और उपकरण महत्वपूर्ण चरणों के लिए विस्तार से वर्णित हैं। एक आवेदन के रूप में, रिपोर्ट माउस गुर्दे से एक solubilized endosome समृद्ध झिल्ली अंश के complexome विश्लेषण का वर्णन करता है, कुल में profiled 2,545 प्रोटीन के साथ. परिणाम वर्दी की पहचान प्रदर्शित करता है, कम बहुतायत झिल्ली प्रोटीन जैसे intracellular आयन चैनलों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उच्च संकल्प, जटिल प्रोटीन विधानसभा पैटर्न, ग्लाइकोसियलेशन आइसोफॉर्म्स सहित. परिणाम स्वतंत्र जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ समझौते में हैं. संक्षेप में, इस पद्धति प्रोटीन की व्यापक और निष्पक्ष पहचान के लिए अनुमति देता है (सुपर) complexes और उनके subunit संरचना, किसी भी में प्रोटीन परिसरों की stoichimetry, विधानसभा, और बातचीत गतिशीलता की जांच के लिए एक आधार प्रदान जैविक प्रणाली.
बीएन-पेज जुदाई पहले सीधे LC-MS विश्लेषण करने के लिए युग्मित किया गया था (BN-MS) Majeran1 और Wessels2 अनुसंधान समूहों द्वारा बीएन-पेज जेल लेन के मैनुअल टुकड़ा करने का उपयोग कर. उनके विश्लेषणों ने पादप प्लास्टिड और एचईके कोशिका माइटोकोंड्रिया से ज्ञात उपइकाई संरचना के साथ प्रचुर मात्रा में झिल्ली प्रोटीन परिसरों की संख्या की पहचान की। हालांकि, ये विश्लेषण व्यापक से दूर थे और उपन्यास विधानसभाओं की निष्पक्ष पहचान के लिए अनुमति नहीं दी. मास स्पेक्ट्रोमीटर और लेबल मुक्त परिमाणीकरण विधियों के निष्पादन में तब से काफी सुधार हुआ है, जिससे व्यापक बीएन-एमएस विश्लेषण सक्षम हुए हैं। इसने “कॉम्प्लेक्सोम प्रोफाइलिंग” शब्द गढ़ा है। उदाहरण के लिए, Heide और सहकर्मियों चूहे दिल mitochondria की पहचान करने और क्लस्टरिंग 464 mitochondrial प्रोटीन का विश्लेषण किया, जिससे कई ज्ञात विधानसभाओं की पुष्टि. इसके अलावा, उन्होंने पाया TMEM126B एक विशिष्ट विधानसभा परिसर3के एक उपन्यास और महत्वपूर्ण उपइकाई हो. एचईके सेल माइटोकोंड्रिया4के समानांतर अध्ययन में तुलनात्मक परिणाम (437 माइटोकोंड्रियाल प्रोटीन प्रोफाइल के साथ) प्राप्त किए गए थे।
इन सुधारों के बावजूद, कई मुद्दे बने हुए हैं जो कॉम्पलेक्सोम प्रोफाइलिंग के लिए BN-MS की पूरी क्षमता को नियंत्रित करते हैं। एक प्रमुख सीमा परिसरों के प्रभावी आकार संकल्प है कि दो कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है: (i) बीएन-पेज जुदाई की गुणवत्ता, जो जेल मैट्रिक्स pores ढाल की एकरूपता के साथ ही नमूना परिसरों की स्थिरता / और (ii) जेल नमूना का चरण आकार, जो पारंपरिक मैनुअल टुकड़ा करने का उपयोग करते समय सबसे अच्छा 1 मिमी है5,6. गरीब आकार संकल्प न केवल सूक्ष्म जटिल isoforms और विषमताओं याद आती है, लेकिन यह भी नकारात्मक गतिशील रेंज और निष्पक्ष, डी नोवो subunit असाइनमेंट और परिमाणीकरण के विश्वास को प्रभावित करता है.
अन्य चुनौतियों प्रोटीन परिमाणीकरण और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा नमूने में प्रोटीन बहुतायत की वास्तविक गतिशील रेंज की कवरेज की परिशुद्धता शामिल हैं. इसलिए, बीएन-एमएस complexome रूपरेखा के आवेदन काफी हद तक कम जटिलता के साथ जैविक नमूनों के लिए प्रतिबंधित बनी हुई है, लक्ष्य परिसरों की उच्च अभिव्यक्ति, और अनुकूल solubilization गुण (यानी, प्लास्टिड, mitochondria, और सूक्ष्मजीव)6,7,8,9,10.
हमने हाल ही में क्रायोमाइक्रोटोम टुकड़ा करने की मदद से बीएन-एमएस (csBN-MS) पेश किया है, जो व्यापक एमएस विश्लेषण के साथ BN-PAGE जेल लेन के सटीक उप-मिलीमीटर नमूने को जोड़ती है और उच्च के साथ प्रोटीन प्रोफाइल के निर्धारण के लिए विस्तृत एमएस डेटा प्रसंस्करण विश्वास11| चूहे दिमाग से एक mitochondrial झिल्ली की तैयारी के लिए आवेदन पहले से अमेट प्रभावी जटिल आकार संकल्प और ऑक्सीडेटिव श्वसन श्रृंखला परिसर (OXPHOS) subunits की अधिकतम कवरेज का प्रदर्शन किया (यानी, 90 एमएस सुलभ के 90). इस उदाहरण में कई नए प्रोटीन असेंबली की भी पहचान की गई है।
यहाँ वर्णित प्रोटीन परिसरों की तैयारी पैमाने BN-पेज जुदाई के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं रहे हैं (एक विशेष जैविक स्रोत के लिए प्रतिबंधित नहीं), बड़े preparative BN-पेज जैल के कास्टिंग, व्यापक जेल गलियों के cryomicrotome टुकड़ा करना, और एमएस डेटा प्रसंस्करण. उच्च संकल्प रूपरेखा के प्रदर्शन माउस गुर्दे endosome समृद्ध झिल्ली से एक प्रोटीन जटिल तैयारी के लिए प्रदर्शन किया है. अंत में, संकल्प और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीट्रिक परिमाणीकरण की परिशुद्धता बढ़ाने से लाभ पर चर्चा कर रहे हैं.
प्रस्तुत अध्ययन csBN-एमएस तकनीक पर बनाया पहले एक mitochondrial तैयारी11 के साथ बेंचमार्क और नमूना तैयारी में सुधार शामिल, जेल प्रसंस्करण, और एमएस डेटा मूल्यांकन. बड़े पैमाने पर जुदाई बीएन-पेज जेल के एक वर्ग के केंद्रित विश्लेषण mitochondrial झिल्ली के साथ अध्ययन करने के लिए तुलनीय गुणवत्ता उपायों दिखा डेटा का एक व्यापक सेट प्रदान की. बड़े पैमाने पर और प्रतिधारण समय त्रुटियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चलाने के लिए रन विविधताओं बहुत कम रखा गया था और विश्वसनीय प्रोटीन बहुतायत प्रोफाइल का निर्धारण करने के लिए आधार प्रदान की. आकार रिज़ॉल्यूशन अच्छा दिखाई दिया, जिसमें छः स्लाइसों के रूप में अर्ध-अधिकतम शिखर चौड़ाई (1.5 मिमी, चित्र 4) और 10% से कम के सापेक्ष आकार के अंतर (चित्र 3, चित्र 5ए) के साथ। इन मूल्यों को पूरी तरह से mitochondria के पिछले CSBN-MS विश्लेषण के आकार संकल्प गुणवत्ता को पूरा नहीं किया (छोटे जेल नमूना कदम आकार चुना के बावजूद), लेकिन वे काफी पारंपरिक बीएन-एमएस या आकार बहिष्कार एमएस के प्रदर्शन से बेहतर कर रहे हैं दृष्टिकोण20 कि हाल ही में लोकप्रिय हो गए हैं.
एक उच्च प्रभावी जटिल आकार संकल्प के महत्व चित्र 3 में सिमुलेशन प्रयोग द्वारा रेखांकित किया है (TPC1 संबद्ध परिसरों का उपयोग करके) कि शायद ही 2D BN/SDS-पेज पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा हल किया जा सकता है (चित्र 1बी). इन परिणामों का सुझाव है कि इस मामले में 0.25 मिमी टुकड़ा कुछ oversampling में हुई, लेकिन यह अभी भी प्रभावी आकार संकल्प समझौता किए बिना “परिमाणीकरण शोर” के उन्मूलन के लिए उपयोगी साबित हुआ. इस प्रकार, पिछले परिणाम11के साथ लाइन में, एक नमूना कदम आकार $0.3 मिमी आम तौर पर सिफारिश की है.
विशेष रूप से, TPC1 संबद्ध परिसरों के भेदभाव पूरी तरह से 1 मिमी जेल नमूना है, जो पारंपरिक बीएन एमएस5,6में मैनुअल टुकड़ा करने के द्वारा प्रदान की सबसे छोटी कदम आकार है के साथ खो दिया है. यह इस तथ्य की व्याख्या कर सकता है कि शक्तिशाली एमएस प्रौद्योगिकियों के उपलब्ध होने के बावजूद, बहुत कम प्रोटीन कॉम्प्लेक्स और उपइकाइयों की पहचान की गई है, जो कॉम्पलेक्स प्रोफाइलिंग द्वारा डी नोवो की पहचान की गई है। इसके अच्छे समाधान की शक्ति के अलावा, csBN-एमएस उच्च बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है. झिल्ली से बंधे परिसरों और घुलनशील प्रोटीन परिसरों 50 केडीए से कई एमडीए तक प्रभावी ढंग से न्यूनतम पूर्वाग्रह11के साथ एक ही प्रयोग में हल किया जा सकता है। वैकल्पिक जुदाई आकार बहिष्करण या आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी की तरह complexome रूपरेखा के लिए इस्तेमाल किया तकनीक के साथ यह विरोधाभास है, जो कुछ आकार पर्वतमाला या प्रभारी गुणों के साथ घुलनशील प्रोटीन के सबसेट के साथ काम करते हैं. नकारात्मक पक्ष पर, CSBN-MS कम स्केलेबल है (अधिकतम लोड $ 3 प्रति जेल मिलीग्राम प्रोटीन), तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और automatized नहीं किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, परिणाम प्रदर्शित करता है कि csBN-MS-आधारित complexome रूपरेखा सफलतापूर्वक गैर-mitochondrial लक्ष्यों के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी कुछ संबद्ध चुनौतियों का संकेत. इस प्रकार, कुशल निष्कर्षण और प्रोटीन परिसरों के जैव रासायनिक स्थिरता अधिक अनुकूलन की आवश्यकता है, और सफाई कदम और अभी भी सीमित हो सकता है. जांच आकार खिड़की के भीतर, अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित की संख्या, monodisperse प्रोटीन परिसरों वास्तव में काफी कम था (डेटा नहीं दिखाया गया) एक mitochondrial नमूना की तुलना में. यह भी स्वीकार्य जेल जुदाई प्राप्त करने के लिए बीएन-पेज नमूना भार को कम करने के लिए सिफारिश की है। उच्च भार व्यापक जेल लेन है कि और अधिक टुकड़ा करने के लिए ठीक से प्रक्रिया करने के लिए कठिन हैं की आवश्यकता हो सकती है (वीडियो के साथ देखें). इसके अलावा, नमूनों की प्रोटीन जटिलता अधिक था (लगभग दो गुना) mitochondria व्युत्पन्न टुकड़ा डाइजेस्ट की तुलना में, अधिक लापता पीवी मूल्यों और एक कम गतिशील रेंज के लिए अग्रणी. वास्तव में, चित्र 5 में दिखाए गए परिसरों का हिस्सा होने की अपेक्षा कुछ छोटे प्रोटीन विश्लेषणों में गायब थे। इन समस्याओं को भविष्य में तेजी से और अधिक संवेदनशील एमएस उपकरणों या डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण मोड का उपयोग करके हल किया जा सकता है.
नमूना तैयारी प्रोटीन जटिल पुनर्प्राप्ति, स्थिरता, और जेल जुदाई गुणवत्ता के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है. पैरामीटर और प्रक्रियाओं प्रत्येक स्रोत ऊतक के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, सेल lysate, झिल्ली (fraction), और ब्याज की प्रोटीन जटिल. CSBN-MS के अनुप्रयोगों का विस्तार करने में मदद कर सकते हैं कि निम्न सामान्य अनुशंसाएँ प्रदान की जाती हैं:
(i) ताजा नमूने तैयार करना और वार्मिंग/फ्रीजिंग, मजबूत कमजोर पड़ने, बफर स्थितियों में परिवर्तन और अनावश्यक विलंब से बचना;
(ii) उन बफरों का उपयोग करना जो अनिवार्य रूप से लवणों से रहित हैं (500-750 एम बीटाइन या एमिनोकैप्रोइक एसिड के साथ बदलें), एक तटस्थ पीएच के बारे में, और गैर-डेनेट्यूरिंग डिटर्जेंट (प्रोटीन: डिटरजेंट अनुपात के बीच 1:4-1:10 झिल्ली के solubilization के लिए) के 1% तक युक्त प्रोटीन परिसरों, घुलनशील प्रोटीन परिसरों के लिए आवश्यक कोई डिटर्जेंट;
(iii) विश्लेषणात्मक बीएन-पेज द्वारा डिटर्जेंट स्थितियों का सावधानीपूर्वक परीक्षण और समायोजन, क्योंकि ये जटिल विलेबिलाइजेशन की दक्षता, नमूना, स्थिरता और एकरूपता में झिल्ली प्रोटीन परिसरों के प्रतिनिधित्व को दृढ़ता से प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटीन-डिटर्जेंट मिसेल। बाद प्रोटीन के लिए आवश्यकताएँ बीएन-पेज जैल पर अलग बैंड / जटिल आबादी के रूप में ध्यान केंद्रित करने के लिए कर रहे हैं। पिछले साहित्य तटस्थ डिटर्जेंट की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है. तथापि, डीडीएम (एन-डोडेसिल जेड-डी-माल्टोसाइड)1,2,4,5,6 और अंकोनिन3,5,7,8, 9,10,13,18 अब तक बी एन-एमएस विश्लेषण के लिए सबसे लोकप्रिय विकल्प रहे हैं। इस बात पर बल दिया जाना चाहिए कि किसी भी डिटर्जेंट की स्थिति अनिवार्य रूप से solubilization दक्षता और प्रोटीन बातचीत के संरक्षण के बीच एक समझौते का प्रतिनिधित्व करता है और समान रूप से लक्ष्य प्रोटीन और स्रोत सामग्री के सभी प्रकार के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है;
(पअ) फाइब्रिल, फिलामेंट, पॉलीलिसिन, डीएनए, और प्रचुर मात्रा में कम आणविक भार घटकों (अर्थात, चयापचयों, लिपिड, या पेप्टाइड्स) जैसे आवेशित पॉलिमर निकालना। यह ultracentrifugation द्वारा पूरा किया जा सकता है, जेल निस्पंदन, या डायलिसिस. यह कुल सेल या ऊतक lysates के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है;
(v) Coomassie जी-250 जोड़ना (अंतिम एकाग्रता 0.05%-0.1%) और sucrose (लोडकरने के लिए घनत्व में वृद्धि करने के लिए, अंतिम एकाग्रता 10%-20% [w/v]) बस लोड करने से पहले नमूना करने के लिए, कम ultracentrifugation द्वारा स्पष्ट करने के लिए, क्षोभ के बिना नमूना लोड, और उसके तुरंत बाद चलाने शुरू करते हैं.
भविष्य के परिप्रेक्ष्य के रूप में, CSBN-MS-आधारित complexome रूपरेखा प्रोटीन जटिल गतिशीलता या विशिष्ट जैविक स्थितियों से संबंधित परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए मल्टीप्लेक्सिंग के लिए विकल्प प्रदान करता है। आकार-अपवर्जन आधारित21 के लिए प्रस्तावित के रूप में चयापचय लेबल नमूनों की संयुक्त जुदाई सीधा दिखाई देता है, लेकिन यह इस्तेमाल जुदाई से स्वतंत्र रूप से होने वाली परिसरों में सहज subunit विनिमय द्वारा बाधित किया जा सकता है विधि. वैकल्पिक रूप से, लेबल नमूने पड़ोसी जेल गलियों में हल किया जा सकता है, जो तब सह टुकड़ा या उच्च संवेदनशीलता और मजबूती के साथ अंतर विश्लेषण के लिए संयुक्त बाद पचा जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG, जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन) द्वारा समर्थित किया गया था – परियोजना आईडी 403222702 – SFB 1381 और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति CIBSS के तहत – EXC-2189 – परियोजना आईडी 390939984. हम तकनीकी सहायता के लिए काटजा जैप को धन्यवाद देते हैं।
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio Rad | #1610158 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13% |
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio Rad | #1610154 | Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13% |
SYPRO Ruby Protein Blot Stain | Bio Rad | #1703127 | Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection |
Coomassie Brilliant Blue G-250 | Serva | no. 35050 | Centrifugate stock solutions prior to use |
ComplexioLyte 47 | Logopharm | CL-47-01 | Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins |
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium | Leica Biosystems | 14020108926 | Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome |
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm | Merck | IPVH00010 | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml | n.a. | n.a. | any supplier, important for making gel section embedding tool |
broad razor blade | n.a. | n.a. | any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes |
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long | n.a. | n.a. | mold for embedding and freezing of gel samples |
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | Nr. 0030108116 | highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption |
sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm | Dionex / Thermo Scientific | P/N 160454 | |
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm) | New Objective | FS360-75-8 | |
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm) | Dr. Maisch GmbH | r13.93. | columns packed manually |
rabbit anti-TPC1 antibody | Gramsch Laboratories | custom production | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | CY-1300 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated | Vector Laboratories | #B1325 | described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12) |
cryo-microtome Leica CM1950 | Leica Biosystems | 14047743905 | |
Mini Protean II Cell with wetblot unit | Bio Rad | n.a. | for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more) |
Penguin Midi Gel Electrophoresis System | PeqLab | n.a. | for BN-PAGE (not sold any more) |
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera | Zeiss / Photometrics | n.a. | |
peristaltic pump (IP high precision multichannel) | Ismatec | ISM940 | for casting of gradient polyacrylamide gels |
gradient mixer with stirring (two chambers) | selfmade, alternatively Bio Rad | 1652000 or 1652001 | for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf) |
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor | Sorvall / Thermo Scientific | n.a. | for sample preparation (not sold any more) |
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC | Dionex / Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMAZQ |