Her præsenterer vi en protokol til at berige, isolere, identificere og karakterisere proteiner modificeret af Sumo in vivo både fra humane hepatoma celler og levertumorer opnået fra musemodeller af hepatocellulært karcinom ved hjælp af Sumo-bindende enheder (subes).
Post-translationel modifikation er en nøglemekanisme, der regulerer proteinhomeostase og funktion i eukaryote celler. Blandt alle ubiquitin-lignende proteiner i leverkræft, modifikationen af SUMO (lille Ubiquitin MOdifier) har fået mest opmærksomhed. Isolering af endogene Sumoylerede proteiner in vivo er udfordrende på grund af tilstedeværelsen af aktive SUMO-specifikke proteaser. De indledende undersøgelser af Sumoylering in vivo var baseret på molekylær påvisning af specifikke Sumoylerede proteiner (f. eks. af Western blot). Men i mange tilfælde, antistoffer, generelt lavet med ikke-modificeret rekombinant protein, ikke immunoprecipitate SUMOylated former af proteinet af interesse. Nikkel kromatografi har været den anden metode til at studere Sumoylering ved at opfange histidinmærkede versioner af SUMO-molekyler. Denne fremgangsmåde anvendes hovedsageligt i celler, der stabilt udtrykker eller transitivt transficeret med hans-Sumo molekyler. For at overvinde disse begrænsninger blev SUMO-bindende enheder (SUBEs) udviklet til at isolere endogene Sumoylerede proteiner. Heri beskriver vi alle de trin, der er nødvendige for berigelse, isolering og identifikation af Sumoylerede substrater fra humane hepatoma-celler og hepatisk væv fra en levercancer-musemodel ved hjælp af SUBEs. For det første beskriver vi metoder, der er involveret i forberedelsen og lysis af de humane hepatoma celler og leveren tumor vævsprøver. Derefter, en grundig forklaring af forberedelsen af SUBEs og kontroller er detaljeret sammen med protokollen for protein pull-down assays. Endelig gives der eksempler på mulighederne for identifikation og karakterisering af det Sumoylerede protein, nemlig anvendelse af Western-blot-analyse til påvisning af et specifikt Sumoyleret substrat fra levertumorer eller anvendelse af proteomics ved massespektrometri for høj gennemløb karakterisering af det Sumoylerede proteom og interactome i hepatoma celler.
Leverkræft er den sjette mest almindeligt forekommende kræft på verdensplan og den anden årsag til kræft-associerede dødsfald1. Hepatocellulær carcinoma (HCC) er den mest fremherskende form for primær leverkræft. Historisk set omfattede almindeligt forekommende risikofaktorer for udvikling af HCC kronisk hepatitis B-eller C-infektion og misbrug af alkoholindtagelse. I de sidste årtier, den Metaboliske syndrom, type 2 diabetes ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD) er opstået som risikofaktorer for udviklingen af HCC2. HCC er meget heterogene, både fænotypisk og genetisk, hvor et komplekst netværk af signalering veje er forstyrret. I de seneste år, selv om der har været en stigning i vores viden om de molekylære veje impliceret i patogenesen af HCC, der er stadig ingen effektive terapeutiske tilgange til HCC ledelse. Mange veje er aktiveret i HCC og hæmmer en generelt driver kompensationen ved andre veje3. Dette har været en af de største vanskeligheder ved behandling af HCC. En mere global tilgang kan således give en potentiel terapeutisk tilgang til klinisk behandling af leverkræft, f. eks., som er rettet mod post-translationelle modifikationer (PTMs), da flere signalveje kan reguleres samtidigt af Ptm’er af proteiner.
Post-translationelle modifikationer betragtes som nøglemekanismer, der regulerer proteinhomeostase og funktioner4. Der indføres strukturelle og funktionelle ændringer af PTMs, hvilket øger proteomet mangfoldighed. De mest almindelige PTMs omfatter fosforylering, methylering, acetylering, glykosylering, allestedsnærværende, og konjugering af ubiquitin-lignende proteiner (UbLs). Blandt alle Ubl’er, protein modifikation af SUMO (lille Ubiquitin MOdifier) har tiltrukket sig opmærksomhed i forbindelse med sin kritiske rolle i en række cellulære processer, herunder transkriptionen, cellulære lokalisering, DNA reparation, og celle cyklus progression 5. for nylig blev sumoylering påvist at være ændret i leverkræft6,7,8,9, og ændringer i sumoylering af specifikke proteiner er blevet beskrevet for at spille en rolle i progression af kræftrelaterede sygdomme9.
I pattedyr, der er fem SUMO paralogues, SUMO-1 til SUMO-5. Til dato, ingen eksperimentelle beviser er tilgængelige om eksistensen af endogene SUMO-4 og endogene SUMO-5 konjugering reaktioner på Proteinniveau10,11,12. Sumoylering i pattedyr udføres af en enzymatisk thiol-ester kaskade, der involverer tre enzymer, det heterodikemeje SUMO-aktiverings enzym (SAE1/SAE2) eller E1, det SUMO-konjugerende enzym (Ubc9) eller E2 og en SUMO-E3-Ligase-specifik for hvert målprotein. Virkningen af flere familier af SUMO E3s synes at være i en dynamisk ligevægt med SUMO-specifikke proteaser (SUSPs eller SENPs)13 gør SUMOylation reaktion meget reversibel. Desuden er kun en lille brøkdel af det Sumoylerede protein versus ikke-Sumoyleret total protein til stede. Derved er isolerende endogene Sumoylerede proteiner in vivo temmelig udfordrende13.
Sumoylering in vivo blev oprindelig undersøgt af Western blot ved hjælp af antistoffer mod proteinet af interesse14. Immunoprecipitation af proteinet blev udført med specifikke antistoffer, og derefter blev PAGE-Western blot udført med anti-SUMO-antistoffer. Det største problem med denne strategi er, at antistoffer genereret mod et ikke-modificeret rekombinant protein ikke altid er i stand til at immunoprecipitere den Sumoylerede form af et protein. Alternativt, nikkel kromatografi efter forbigående ekspression af histidin Tagged (His6) versioner af SUMO molekyler og protein af interesse er blevet brugt til at studere Sumoylering i celler. På dette grundlag vil det være mere bekvemt at opdage Sumo-modificerede former fra celler, der stabilt udtrykker His6-Sumo15. Til in vivo-undersøgelser blev det påvist, at tandem-SUMO-interagerende motiver (SIM)-baseret berigelse var til rensning af polySUMO-konjugater16. Andre grupper har brugt epitope-Tagged antistof Sumo tilgange giver et gennemførligt værktøj til at undersøge endogene sumoylering i primære celler, væv, og organer17,18. Og for nylig har Nielsen og kolleger brugt antistof-baseret berigelse til at identificere endogene og stedspecifikke SUMO i celler og væv19.
For at give supplerende oplysninger om SUMOylation in vivo blev der udviklet SUMO-bindende enheder (SUBEs), også kendt som SUMO-fælder,20. Af relevans betragtes tandem ubiquitin-bindende enheder (rør) som konceptuelle forløbere for SUBEs og er kommercielt tilgængelige værktøjer til påvisning og isolering af polyubiquitylerede proteiner21. SUBEs er rekombinante proteiner, der omfatter tandem gentagelser af simmere og derved genkender SUMO-molekyler på modificerede proteiner med en stigning i den samlede affinitet for SUMO-substrater. SUMO-fælder blev manipuleret ved at introducere en E3 ubiquitin-protein ubiquitinligase RNF4-afledte SIM2 og SIM3 motiver i tandem, i en vektor, der indeholder glutathion S-transferase (GST), et heterologt bære protein20. Selv om SUBEs ikke kan anvendes korrekt til at identificere mono-SUMOylated målproteiner, denne metode giver et værktøj til at lette rensning og identifikation af poly-SUMO Target proteiner in vivo. Heri beskriver vi anvendelsen af SUBEs for at isolere Sumoylerede proteiner både i humane hepatoma celler og i mus leverbiopsier, et vigtigt redskab til studiet af leverkræft. En overordnet ordning i den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, er vist i figur 1.
Heri har vi givet en fuldstændig og detaljeret beskrivelse af den metode, der rapporterer brugen af SUBEs til berigelse, isolering og identifikation og karakterisering af de Sumoylerede proteiner i in vivo-modeller af leverkræft. Både i mus levertumorer og humane hepatoma celler, vi var i stand til korrekt isolere og identificere sumoylated proteiner af interesse og til at udføre en høj gennemløb karakterisering af sumoylated proteom og interactome. Selv om syntesen af SUBEs er uden for rammerne af dette manuskript, for yderligere oplysninger følgende henvisninger bør ses på26. Den beskrevne protokol er hurtig og meget følsom, og det kritiske trin i protokollen omfatter brugen af SENPs-hæmmere (PR-619). Alternativt kan der anvendes kemiske isopeptidasehæmmere såsom NEM (N-ethylmaleimid) og IAS (2-Iodoacetamid) i lysis-bufferen, men tidligere rapporter har vist, at for subes-protokollen er brugen af PR-619 fordelagtig som den anden inhibitorer interfererer med GST binding til glutathionperler20.
SUBEs er rekombinante proteiner, der omfatter tandem gentagelser af simmere og derved genkender SUMO-molekyler på modificerede proteiner med en stigning i den samlede affinitet for SUMO-substrater. På grund af dets høje specificitet og følsomhed er brugen af subes til isolering af det sumoylerede proteom fordelagtigt i forhold til andre tilgange i litteraturen, såsom påvisning af Western-blot af specifikke sumoylerede proteiner ved hjælp af antistoffer mod det protein af interesse eller nikkel kromatografi ved hjælp af de forskellige histidin-mærkede versioner af SUMO molekyler. Det skal dog tages i betragtning, at da SUBEs-protokollen udføres under ikke-Denaturerings betingelser, opretholdes interaktionen mellem Sumoylerede proteiner og andre interagerende proteiner. Derfor får vi oplysninger om SUMO interactome i stedet for kun en liste over SUMOylated målproteiner. Der er således behov for yderligere eksperimenter for at bekræfte, om det identificerede protein er et SUMO-mål eller en interagerende faktor. Anden begrænsning af SUBEs er det faktum, at kontrol GST fælder bruges er i stand til at fange mange baggrunds proteiner relateret til oxidativt stress. Dette problem er især relevant i MS-analysen på grund af den høje følsomhed af teknikken. For at overvinde disse begrænsninger er der blevet udviklet biotinylerede SUMO-fælder (bioSUBEs)26. En anden begrænsning af SUBEs er bosat i det faktum, at vi kun er i stand til at fange proteiner modificeret af SUMO 2 og SUMO 3, hvorimod SUMO 1-modificerede proteiner ikke kan isoleres.
Andre betænkeligheder ved anvendelsen af SUBEs er relateret til mængden af udgangsmateriale, der er nødvendigt for proceduren. Udgangsmaterialet, der anvendes til at indfange Sumoylerede proteiner, bør tage hensyn til de forskellige eksperimentelle betingelser. Mens basal Sumoylering er blevet rapporteret i forskellige cellulære sammenhænge, SUMOylation er en proces, der er stærkt induceret efter flere stress betingelser/stimuli. Hvis man sammenligner ubehandlet versus behandlede prøver, skal man være sikker på, at kolonnen ikke er mættet, og forskelle kan observeres mellem disse betingelser. I tilfælde af mus fænotyper vi analyserer, ingen behandlinger er blevet brugt og basal Sumoylering niveauer er lave. Af denne grund, store mængder af proteiner blev brugt. Baggrundsniveauet skal styres ved hjælp af GST, og hvis den uspecifikke binding er høj, skal mængden af udgangsmateriale eller bindingstiden reduceres. Analysen af FT-fraktionen kan være en indikation af indfangningseffektiviteten, selv om disse fælder foretrækker poly-Sumoylerede proteiner, og en total nedbrydning ikke bør forventes, en reduktion af den totale Sumoylering er generelt godt observeret, når erobrings effektiviteten er Optimal.
Endelig, anden anvendelse af SUBEs teknologi omfatter kombinationen af SUBEs teknologi med real-time overflade Plasmon resonans (SPR) tillader real-time interaktioner med SUMOylated proteiner fra celleekstrakter27. Også, for nylig, biotinylated SUMO-fælder (bioSUBEs) er blevet udviklet med den fordel at reducere baggrunden i forbindelse med større Tags, f. eks, under massespektrometri analyse26. Desuden kan bioSUBE-versionen anvendes til at detektere Sumoylerede proteiner i levende celler ved fluorescens ved hjælp af streptavidin-mærket med særskilte fluorescerende farvestoffer, der udnytter streptavidin binding til biotin. Desuden kan metoder til påvisning og kvantificering af Sumoylerede proteiner overvejes med både GST og bioSUBEs versioner som det blev gjort med tandem ubiquitin bindende enheder (rør)21.
Samlet set er brugen af SUBEs til isolation og karakterisering af det Sumoylerede proteom relevant i leverkræft en hurtig og følsom metode, der giver store oplysninger om den stadig temmelig ukendte rolle af SUMOylation pathway i leverkræft.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du cancer, FRANCE, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 og REPERE-programmet for Occitanie, Frankrig (M.S.R.). Også NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de Salud 2013111114 (til M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER, BIOEF (det baskiske Institut for innovation og sundhedsforskning): EITB Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de Salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en el plan Estatal de Investigación cientifica y Técnica y Innovación 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER (til M.L.M.-C), Asociación Española contra El cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award fra EASL (til T. C. D), Fundación Científica de la Asociación Española contra El cancer (AECC Scientific Foundation) sjælden tumor opkald 2017 (til M. L. M), La Caixa Foundation program (til M. L. M). Vi takker MINECO for Severo Ochoa Excellence-akkrediteringen til CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
BSA | Sigma | A4503 | |
C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
DTT | Sigma | 43815 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | e9644 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
NaCl | Merck | 106404041000 | |
nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
NP40 | Fluka | 74385 | |
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
PR-619 | Merck | 662141 | |
Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |