यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए समृद्ध, अलग, पहचान, और दोनों मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ट्यूमर से मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ट्यूमर से vivo में संशोधित प्रोटीन की विशेषता SUMO बाध्यकारी संस्थाओं का उपयोग करके hepatocellular कार्सिनोमा के माउस मॉडल से प्राप्त (SUBEs).
पोस्ट-ट्रांस्लेशनल संशोधन प्रोटीन होमियोस्टेसिस को विनियमित करने वाला एक महत्वपूर्ण तंत्र है और यूकैरियोटिक कोशिकाओं में कार्य करता है। यकृत कैंसर में सभी सर्वव्यापक प्रोटीन की तरह, SUMO द्वारा संशोधन (लघु Ubicuitin MOdifier) सबसे अधिक ध्यान दिया गया है. विवो में अंतर्जात सुमोइलित प्रोटीन का अलगाव सक्रिय सूमो-विशिष्ट प्रोटीज़ की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण है। विवो में सुमोयलेशन के प्रारंभिक अध्ययन विशिष्ट सुमोयलेट प्रोटीन (जैसे, पश्चिमी धब्बा द्वारा) के आणविक पता लगाने पर आधारित थे। हालांकि, कई मामलों में, एंटीबॉडी, आम तौर पर गैर संशोधित पुनः संयोजक प्रोटीन के साथ बनाया, ब्याज की प्रोटीन के इम्यूनोप्रिसिपेट SUMOylated रूपों नहीं किया. निकल क्रोमैटोग्राफी सूमो अणुओं के histidine-tagged संस्करणों पर कब्जा करके SUMOylation का अध्ययन करने के लिए अन्य दृष्टिकोण रहा है। यह दृष्टिकोण मुख्य रूप से उनकी-SUMO अणुओं के साथ stably व्यक्त या क्षणिक रूप से transfected कोशिकाओं में प्रयोग किया जाता है. इन सीमाओं को दूर करने के लिए, सूमो बाध्यकारी संस्थाओं (SUBEs) अंतर्जात SUMOylated प्रोटीन को अलग करने के लिए विकसित किए गए थे. इसमें, हम सब संवर्धन, अलगाव के लिए आवश्यक कदम का वर्णन, और SUBEs का उपयोग करके एक जिगर के कैंसर माउस मॉडल से मानव hepatoma कोशिकाओं और यकृत ऊतकों से SUMOylated substrates की पहचान. सबसे पहले, हम मानव hepatoma कोशिकाओं और जिगर ट्यूमर ऊतक के नमूने की तैयारी और lysis में शामिल तरीकों का वर्णन. फिर, SUBEs और नियंत्रण की तैयारी की एक पूरी तरह से विवरण प्रोटीन पुल नीचे परख के लिए प्रोटोकॉल के साथ विस्तृत है. अंत में, कुछ उदाहरण की पहचान और SUMOylated proteome, अर्थात् जिगर ट्यूमर या उपयोग से एक विशिष्ट SUMOylated सब्सट्रेट का पता लगाने के लिए पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के उपयोग की विशेषता के लिए उपलब्ध विकल्पों के बारे में प्रदान की जाती हैं हेपेटोमा कोशिकाओं में सुमोयलेटिड प्रोटीओम और इंटरैक्टोम के उच्च थ्रूपुट लक्षण के लिए जन स्पेक्ट्रममिति द्वारा प्रोटीओमिक्स की।
लिवर कैंसर दुनिया भर में छठा सबसे आम कैंसर है और कैंसर से जुड़ी मौतों का दूसरा कारण1. हेप्टोकोशिकीय कार्सिनोमा (एचसीसी) प्राथमिक यकृत कैंसर का सबसे प्रचलित रूप है। ऐतिहासिक रूप से, एचसीसी के विकास के लिए आम जोखिम कारकों में क्रोनिक हेपेटाइटिस बी या सी संक्रमण और अपमानजनक शराब की खपत शामिल थी। पिछले दशकों में, चयापचय सिंड्रोम, प्रकार 2 मधुमेह गैर शराबी फैटी लीवर रोग (NAFLD) एचसीसी2के विकास के लिए जोखिम कारक के रूप में उभरा है। एचसीसी बहुत विषम है, दोनों phenoआमरूपऔर और आनुवंशिक रूप से, जिसमें संकेतन रास्ते का एक जटिल नेटवर्क बाधित कर रहे हैं. पिछले वर्षों में, भले ही एचसीसी के रोगजनन में फंसा आणविक रास्ते के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है, फिर भी एचसीसी प्रबंधन के लिए कोई प्रभावी चिकित्सीय दृष्टिकोण नहीं है। कई रास्ते एचसीसी में सक्रिय हो जाते हैं और एक को रोकते हैं जो आम तौर पर अन्य मार्गों3द्वारा मुआवजे को चलाता है। एचसीसी के इलाज के दौरान यह मुख्य कठिनाइयों में से एक रहा है। इस प्रकार, एक और अधिक वैश्विक दृष्टिकोण जिगर के कैंसर के नैदानिक प्रबंधन के लिए एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं जैसे, पोस्ट-अनुवाद संशोधनों (PTMs) को लक्षित, के रूप में कई संकेतन रास्ते एक साथ प्रोटीन के PTMs द्वारा विनियमित किया जा सकता है.
अनुवादके बाद के संशोधनों को प्रोटीन होस्टेसिस और कार्यों को विनियमित करने वाले प्रमुख तंत्र के रूप में माना जाताहै। संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन PTMs द्वारा शुरू कर रहे हैं, जिससे, proteome विविधता में वृद्धि. सबसे आम पीटीएम में फॉस्फोरिलेशन, मिथाइलेशन, एसिटाइलेशन, ग्लाइकोसिकेशन, सर्वव्यापकता, और सर्वव्यापक प्रोटीन (यूबीएल) का संयोजन शामिल है। सभी UbLs के अलावा, SUMO द्वारा प्रोटीन संशोधन (छोटे Ubicuitin MOdifier) सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका के साथ सहयोग में ध्यान आकर्षित किया है, प्रतिलेखन सहित, सेलुलर स्थानीयकरण, डीएनए की मरम्मत, और सेल चक्र प्रगति 5. हाल ही में, SUMOylation जिगर के कैंसरमेंबदल दिखाया गया था 6,7,8,9, और विशिष्ट प्रोटीन के SUMOylation में परिवर्तन की प्रगति में एक भूमिका निभाने के लिए वर्णित किया गया है कैंसर से संबंधित बीमारियों9|
स्तनधारियों में, पांच सूमो पैरालॉग, सूमो-1 से सुमो-5 होते हैं। आज तक, अंतर्जात सूमो-4 और अंतर्जात सूमो-5 के अस्तित्व के बारे में कोई प्रयोगात्मक साक्ष्य प्रोटीन स्तर10,11,12पर उपलब्ध नहीं है। स्तनधारियों में सुमोयलेशन एक एंजाइमी थायोल-एस्टर झरना द्वारा किया जाता है जिसमें तीन एंजाइम शामिल होते हैं, हेटोऑडिमिक सूमो सक्रिय एंजाइम (SAE1/SAE2) या E1, SUMO संयोजन एंजाइम (Ubc9) या E2 और प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए एक SUMO-E3-ligase विशिष्ट। SUMO E3s के कई परिवारों की कार्रवाई SUMO-विशिष्ट proteases (SUSPs या SENPs)13 SUMOylation प्रतिक्रिया अत्यधिक प्रतिवर्ती बनाने के साथ एक गतिशील संतुलन में प्रतीत होता है. इसके अलावा, केवल SUMYlated प्रोटीन का एक छोटा सा अंश बनाम गैर-SUMYlated कुल प्रोटीन मौजूद है. इस तरह, विवो में अंतर्जात सुमोइलित प्रोटीन को अलग करना13के बजाय चुनौतीपूर्ण है।
विवो में सुमोयलेशन का अध्ययन शुरू में पश्चिमी दाग द्वारा ब्याजकेप्रोटीन के विरुद्ध एंटीबॉडी द्वारा किया जाता था . प्रोटीन का इम्यूनोवेरेशन विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ किया गया था और फिर पेज-वेस्टर्न ब्लॉट एंटी-सुमो एंटीबॉडी के साथ किया गया था। इस रणनीति के साथ मुख्य समस्या यह है कि एक गैर संशोधित पुनः संयोजक प्रोटीन के खिलाफ उत्पन्न एंटीबॉडी हमेशा एक प्रोटीन के SUMOylated रूप प्रतिरक्षा करने में सक्षम नहीं हैं. वैकल्पिक रूप से, निकैल क्रोमैटोग्राफी के बाद histidine टैग (His6) SUMO अणुओं के संस्करणों और ब्याज के प्रोटीन कोशिकाओं में SUMOylation अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस आधार पर, यह और अधिक सुविधाजनक होगा SUMO संशोधित रूपों का पता लगाने के लिए कोशिकाओं से stably His6-SUMO15व्यक्त . विवो अध्ययन में, अग्रानुक्रम-सुमो-इंटरैक्टिंग रूपांकनों (सिम) आधारित संवर्धन पॉलीसूमो के शुद्धिकरण के लिए प्रदर्शन किया गया था16. अन्य समूह प्राथमिक कोशिकाओं, ऊतकों औरअंगोंमें अंतर्जात सुमोयलेशन की जांच करने के लिए एक व्यवहार्य उपकरण प्रदान करने वाले एपिटो-टैग किए गए एंटीबॉडी सूमो दृष्टिकोणों का उपयोग कर रहेहैं। और हाल ही में, नीलसन और उनके सहयोगियों ने कोशिकाओं और ऊतकों में अंतर्जात और साइट-विशिष्ट सूमो की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन का उपयोग कियाहै।
विवो में सुमोयलेशन की भूमिका के बारे में पूरक जानकारी प्रदान करने के लिए, सुमो-बाध्यकारी इकाइयों (SUBEs), जिसे सुमो ट्रैप के नाम से भी जाना जाता है,20विकसित किया गया था। प्रासंगिकता की, अग्रानुक्रम सर्वव्यापकता बाध्यकारी संस्थाओं (TUBEs) SUBEs के संकल्पनात्मक अग्रदूत माना जाता है और पॉलीयूबिक्विटीलेटेड प्रोटीन21का पता लगाने और अलगाव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण हैं। SUBEs पुनः संयोजक प्रोटीन है कि सिम के अग्रानुक्रम दोहराता शामिल हैं जिससे SUMO substrates के लिए समग्र संबंध में वृद्धि के साथ संशोधित प्रोटीन पर SUMO अणुओं को पहचानने. सुमो-ट्रैप एक E3 सर्वव्यापक प्रोटीन लिगाज़ RNF4 व्युत्पन्न सिम 2 और सिम3 रूपांकनों एक साथ मिलकर, glutathione एस-ट्रांसफरेस (जीएसटी), एक विषमवाहक वाहक प्रोटीन20युक्त एक वेक्टर में शुरू करके इंजीनियर थे। हालांकि SUBEs ठीक से मोनो-SUMOylated लक्ष्य प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, इस विधि के शुद्धिऔर विवो में पाली-SUMO लक्ष्य प्रोटीन की पहचान की सुविधा के लिए एक उपकरण प्रदान करता है. इसमें, हम दोनों मानव hepatoma कोशिकाओं में और माउस जिगर बायोप्सी, जिगर के कैंसर के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण में SUMOylated प्रोटीन को अलग करने के लिए SUBEs के आवेदन का वर्णन. इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल की एक समग्र योजना चित्र 1 में दर्शायीगई है।
इसमें, हमने यकृत कैंसर के विवो मॉडल में संवर्धन, अलगाव और पहचान और सुमोयलेत प्रोटीन के लक्षण के लिए SUBEs के उपयोग की रिपोर्ट करने वाली पद्धति का एक पूर्ण और विस्तृत विवरण प्रदान किया है। दोनों माउस जिगर ट्यूमर और मानव hepatoma कोशिकाओं में, हम सही ढंग से अलग करने और ब्याज की SUMOylated प्रोटीन की पहचान करने के लिए और SUMOylated प्रोटीओम और interactome के एक उच्च throughput लक्षण प्रदर्शन करने में सक्षम थे. यद्यपि SUBEs का संश्लेषण इस पांडुलिपि के दायरे से बाहर है, फिर भी अधिक जानकारी के लिए निम्नलिखित संदर्भों को26पर देखा जाना चाहिए . वर्णित प्रोटोकॉल तेजी से और बहुत संवेदनशील है और प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम SENPs inhibitors (पीआर-619) का उपयोग भी शामिल है. वैकल्पिक रूप में, रासायनिक आइसोप्टिडेस इनहिबिटर जैसे एनईएम (एन-एथिलमेलीमाइड) और आईएए (2-इडोएमैटाइड) lysis बफर में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, पिछले रिपोर्टों से पता चला है कि SUBEs प्रोटोकॉल के लिए, पीआर-619 का उपयोग अन्य के रूप में फायदेमंद है अवरोधक जीएसटी के साथ हस्तक्षेप करते हैं जो ग्लूटाथिओन मोती20के लिए बाध्यकारी है .
SUBEs पुनः संयोजक प्रोटीन है कि सिम के अग्रानुक्रम दोहराता शामिल हैं जिससे SUMO substrates के लिए समग्र संबंध में वृद्धि के साथ संशोधित प्रोटीन पर SUMO अणुओं को पहचानने. इसकी उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के कारण, SUMOylated proteome के अलगाव के लिए SUBEs का उपयोग इस तरह के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट SUMOylated प्रोटीन के पश्चिमी-ब्लॉट द्वारा पता लगाने के रूप में साहित्य में अन्य दृष्टिकोण के सापेक्ष फायदेमंद है ब्याज का प्रोटीन या सुमो अणुओं के विभिन्न हिस्टोडाइन टैग संस्करणों का उपयोग कर निकल क्रोमैटोग्राफी। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि के रूप में SUBEs प्रोटोकॉल गैर denaturing शर्तों के तहत किया जाता है, SUMOylated प्रोटीन और अन्य बातचीत प्रोटीन के बीच बातचीत बनाए रखा है. इसलिए, हम केवल SUMO interactome के बारे में जानकारी प्राप्त करने के बजाय केवल SUMOylated लक्ष्य प्रोटीन की एक सूची. इस प्रकार, आगे के प्रयोगों की पुष्टि करने के लिए यदि पहचान प्रोटीन एक SUMO लक्ष्य या एक बातचीत कारक है आवश्यक हैं. SUBEs की अन्य सीमा तथ्य यह है कि उपयोग किए गए जीएसटी जाल को नियंत्रित करने के लिए कई पृष्ठभूमि ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित प्रोटीन पर कब्जा करने में सक्षम हैं। इस मुद्दे को विशेष रूप से तकनीक की उच्च संवेदनशीलता के कारण एमएस विश्लेषण के दौरान प्रासंगिक है. इन सीमाओं को पार करने के लिए बायोटिनलेट्ड सूमो-ट्रैप (बायोसब) को26विकसित किया गया है। SUBEs की एक अन्य सीमा तथ्य यह है कि हम केवल सूमो 2 और SUMO 3 द्वारा संशोधित प्रोटीन पर कब्जा करने में सक्षम हैं में रहता है जबकि SUMO 1-संशोधित प्रोटीन अलग नहीं किया जा सकता है.
SUBEs के उपयोग की अन्य चिंता प्रक्रिया के लिए आवश्यक प्रारंभिक सामग्री की मात्रा से संबंधित है। SUMOylated प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया प्रारंभिक सामग्री का पता लगाया विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों पर विचार करना चाहिए. जबकि बेसल SUMOylation विभिन्न सेलुलर संदर्भों में सूचित किया गया है, SUMOylation एक प्रक्रिया है कि दृढ़ता से कई तनाव की स्थिति के बाद प्रेरित है / इलाज के नमूनों बनाम अनुपचारित की तुलना करते हैं, तो एक स्तंभ संतृप्त नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए है, और मतभेद उन स्थितियों के बीच मनाया जा सकता है। माउस phenotypes हम विश्लेषण कर रहे हैं के मामले में, कोई उपचार इस्तेमाल किया गया है और बेसल SUMOylation स्तर कम कर रहे हैं. इस कारण से, प्रोटीन की उच्च मात्रा में इस्तेमाल किया गया. जीएसटी का उपयोग करके पृष्ठभूमि स्तर को नियंत्रित किया जाना चाहिए और यदि विशिष्ट बाइंडिंग अधिक है, तो प्रारंभिक सामग्री या बाइंडिंग समय की मात्रा कम की जानी चाहिए। एफटी अंश का विश्लेषण कब्जा दक्षता का संकेत हो सकता है भले ही इन जाल पाली-SUMOylated प्रोटीन पसंद करते हैं और कुल कमी की उम्मीद नहीं की जानी चाहिए, कुल SUMOylation की कमी सामान्य रूप से अच्छी तरह से मनाया जाता है जब कब्जा दक्षता है इष्टतम.
अंत में, SUBEs प्रौद्योगिकी के अन्य आवेदन वास्तविक समय सतह Plasmon अनुनाद (एसपीआर) सेल निष्कर्षों से SUMOylated प्रोटीन के साथ वास्तविक समय बातचीत की अनुमति के साथ SUBEs प्रौद्योगिकी का संयोजन भी शामिल है27. इसके अलावा, हाल ही में, biotinylated SUMO-ट्रैप (बायोसब) बड़े टैग करने के लिए जुड़े पृष्ठभूमि को कम करने के लिए लाभ के साथ विकसित किया गया है, उदा, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान26. इसके अलावा, bioSUBE संस्करण बायोटिन के लिए बाध्यकारी स्ट्रेपटेविडिन के साथ अलग फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल का उपयोग करके फ्लोरोसेंट द्वारा जीवित कोशिकाओं में SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने और परिमाणीकरण के तरीकों दोनों जीएसटी और bioSUBEs संस्करणों के साथ विचार किया जा सकता है जैसे कि यह अग्रानुक्रम सबबीक्विटीन बाध्यकारी संस्थाओं (TUBEs)21के साथ किया गया था।
कुल मिलाकर, जिगर के कैंसर में प्रासंगिक SUMOylated proteome के अलगाव और विशेषता के लिए SUBEs का उपयोग एक तेज और संवेदनशील विधि जिगर के कैंसर में SUMOylation मार्ग की अभी भी बल्कि अज्ञात भूमिका पर विशाल जानकारी प्रदान है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम Institut राष्ट्रीय du कैंसर, FRANCE, INCa अनुदान PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-एसआर (मैक्सिको) अनुदान 0280365 और Occitanie, फ्रांस (M.S.R.) के REPERE कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. इसके अलावा, NIH (अमेरिकी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग)-R01AR001576-11A1, गोबिर्नो वास्को-डिपार्टमेंटो डी सालुड 2013111114 (M.L.M.-C करने के लिए), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en el Estatal de Investigaci]n Cientifica y T$cnica y Innovaci]n 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER, BIOEF (बास्क फाउंडेशन फॉर इनोवेशन एंड हेल्थ रिसर्च): EITB Maratoia BIO15/ Instituto de Salud कार्लोस III:PIE14/ integrado en el Plan Estatal de Investigaci]n Cientifica y T$cnica y Innovaci]n 2013-2016 cofinanciado con Fondos FEDER (M.L.M.-C), Asociaci]n Espa]ola एल सीजेआर (टी.सी.डी., एम.एल.एम.सी.) EASL (T.C.D करने के लिए), Fundaci]n Cient]fica de la Asociaci]n Espa$ola Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) दुर्लभ ट्यूमर कॉल 2017 (M.L.M करने के लिए), ला Caixa फाउंडेशन कार्यक्रम (M.L.M. करने के लिए). सीआईसी बायोगन (एसईवी-2016-0644) के लिए सेवरो ओको एक्सीलेंस प्रत्यायन के लिए हम मिंको को धन्यवाद देते हैं।
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
BSA | Sigma | A4503 | |
C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
DTT | Sigma | 43815 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | e9644 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
NaCl | Merck | 106404041000 | |
nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
NP40 | Fluka | 74385 | |
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
PR-619 | Merck | 662141 | |
Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |