Her presenterer vi en protokoll for å berike, isolere, identifisere og karakterisere proteiner modifisert av SUMO in vivo både fra humant hepatosarkom celler og leverskader svulster Hentet fra musemodeller av leverkreft ved hjelp av SUMO-bindende enheter (SUBEs).
Post-translational modifikasjon er en viktig mekanisme som regulerer protein homeostase og funksjon i eukaryote celler. Blant alle ubiquitin proteiner i leverkreft, har endringen av SUMO (Small Ubiquitin spesial) fått mest oppmerksomhet. Isolering av endogene SUMOylated proteiner in vivo er utfordrende på grunn av tilstedeværelsen av aktive SUMO-spesifikke proteaser. Innledende studier av SUMOylation in vivo var basert på molekyl deteksjon av spesifikke SUMOylated-proteiner (f.eks. ved Western Blot). Men i mange tilfeller, antistoffer, vanligvis laget med ikke-modifisert rekombinant protein, ikke immunoprecipitate SUMOylated former av protein av interesse. Nikkel kromatografi har vært den andre tilnærmingen til å studere SUMOylation ved å fange histidin-kodede versjoner av SUMO molekyler. Denne tilnærmingen er i hovedsak brukt i celler stabilt uttrykker eller midlertidig transfekterte med hans-SUMO molekyler. For å overkomme disse begrensningene ble SUMO-bindende enheter (SUBEs) utviklet for å isolere endogene SUMOylated proteiner. Heri, beskriver vi alle trinnene som kreves for berikelse, isolasjon, og identifisering av SUMOylated underlag fra humant hepatosarkom celler og hepatic vev fra en leverkreft mus modell ved hjelp SUBEs. For det første beskriver vi metoder involvert i utarbeidelse og lyse av den menneskelige hepatosarkom celler og lever svulst vevsprøver. Deretter, en grundig forklaring av utarbeidelse av SUBEs og kontroller er detaljert sammen med protokollen for protein pull-Down analyser. Endelig, noen eksempler er gitt om de tilgjengelige alternativene for identifisering og karakterisering av SUMOylated proteom, nemlig bruk av Western-Blot analyse for påvisning av en bestemt SUMOylated substrat fra leverskader svulster eller bruk av Proteomikk av masse massespektrometri for høy gjennomstrømming karakterisering av SUMOylated proteom og interactome i hepatosarkom celler.
Leverkreft er den sjette mest vanlige kreft i verden og den andre årsaken til kreft-assosiert dødsfall1. Leverkreft (HCC) er den mest rådende formen for primær leverkreft. Historisk felles risikofaktorer for utviklingen av HCC inkluderte kronisk hepatitt B eller C-smitte og støtende alkoholforbruk. I de siste ti årene, Metabolsk syndrom, type 2 diabetes alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) har dukket opp som risikofaktorer for utvikling av HCC2. HCC er svært heterogen, både phenotypically og genetisk, karakterisert ved at et komplekst nettverk av signal veier blir forstyrret. I de siste årene, selv om det har vært en økning i vår kunnskap om den molekylære trasé innblandet i patogenesen av HCC, er det fortsatt ingen effektive terapeutiske tilnærminger for HCC ledelse. Mange trasé er aktivert i HCC og hemme en generelt kjører kompensasjon av andre trasé3. Dette har vært en av de viktigste vanskelighetene ved behandling av HCC. Således, en mer global tilnærming kan gi en potensiell terapeutisk tilnærming for klinisk forvaltning av leverkreft f. eks, målretting post-translational modifikasjoner (PTMs), som flere signalering trasé kan samtidig reguleres av PTMs av proteiner.
Post-translational modifikasjoner er ansett som viktige mekanismer som regulerer protein homeostase og funksjoner4. Strukturelle og funksjonelle endringer er innført av PTMs, og dermed øke proteom mangfold. De vanligste PTMs inkluderer fosforylering, metylering, acetylering, glykosylering, ubiqitinering og Bøyning av ubiquitin proteiner (UbLs). Blant alle UbLs, protein modifikasjon av SUMO (Small Ubiquitin spesial) har tiltrukket seg oppmerksomhet i samarbeid med sin kritiske rolle i en rekke cellulære prosesser, inkludert transkripsjon, mobilnettet lokalisering, DNA reparasjon, og celle syklus progresjon 5. nylig ble SUMOylation vist å være endret i leverkreft6,7,8,9, og endringer i SUMOylation av spesifikke proteiner har blitt beskrevet for å spille en rolle i utviklingen av kreft-relaterte sykdommer9.
I pattedyr, er det fem SUMO paralogues, SUMO-1 til SUMO-5. Hittil er ingen eksperimentelle bevis tilgjengelig om eksistensen av endogene SUMO-4 og endogene SUMO-5 Bøyning reaksjoner på protein nivå10,11,12. SUMOylation i pattedyr er utført av en enzymatisk tiolderivat-Ester kaskade med tre enzymer, den heterodimeric SUMO aktivering enzym (SAE1/SAE2) eller E1, det SUMO bøye enzymet (Ubc9) eller E2 og en SUMO-E3-ligase spesifikke for hvert mål protein. Handlingen av flere familier av SUMO E3s synes å være i en dynamisk likevekt med SUMO-spesifikke proteaser (SUSPs eller SENPs)13 gjør SUMOylation reaksjonen svært reversibel. Videre, bare en liten brøkdel av SUMOylated protein versus ikke-SUMOylated totalt protein er tilstede. Derved er isolere endogene SUMOylated proteiner in vivo ganske utfordrende13.
SUMOylation in vivo ble opprinnelig studert av Western Blot ved hjelp av antistoffer mot proteinet av interesse14. Immunutfelling av proteinet ble utført med spesifikke antistoffer og deretter PAGE-Western Blot ble utført med anti-SUMO antistoffer. Hovedproblemet med denne strategien er at antistoffer generert mot en ikke-modifisert rekombinant protein er ikke alltid i stand til å immunoprecipitate den SUMOylated form av et protein. Alternativt, nikkel kromatografi etter forbigående uttrykk for histidin tagget (His6) versjoner av SUMO molekyler og protein av interesse har blitt brukt til å studere SUMOylation i celler. På dette grunnlaget, vil det være mer praktisk å oppdage SUMO-modifiserte skjemaer fra celler stabilt uttrykker His6-SUMO15. For in vivo studier, tandem-SUMO-samspill motiver (SIM) basert berikelse ble demonstrert for rensing av polySUMO konjugater16. Andre grupper har brukt epitope-Tagged antistoff Sumo tilnærminger som gir et gjennomførbart verktøy for å undersøke endogene SUMOylation i primær celler, vev, og organer17,18. Og mer nylig, Nielsen og kolleger har brukt antistoff-baserte berikelse å identifisere endogene og områdespesifikke SUMO i celler og vev19.
For å gi utfyllende informasjon om rollen som SUMOylation in vivo, ble SUMO-bindende enheter (SUBEs), også kjent som SUMO feller, utviklet20. Av relevans, tandem ubiquitin bindende enheter (rør) anses konseptuelle forløpere for SUBEs og er kommersielt tilgjengelige verktøy for påvisning og isolering av polyubiquitylated proteiner21. SUBEs er rekombinant proteiner som utgjør tandem repetisjoner av Simmer som dermed erkjenner SUMO molekyler på modifiserte proteiner med en økning i den samlede affinitet for SUMO underlag. SUMO-feller ble utviklet ved å innføre en E3 ubiquitin-protein ligase RNF4-avledet SIM2 og SIM3 motiver i tandem, i en vektor som inneholder glutation S-glutamyltransferase (GST), en heterologous carrier protein20. Selv om SUBEs ikke kan brukes riktig for å identifisere mono-SUMOylated mål proteiner, gir denne metoden et verktøy for å lette rensing og identifisering av Poly-SUMO Target proteiner in vivo. Heri beskriver vi anvendelsen av SUBEs å isolere SUMOylated proteiner både i menneskelige hepatosarkom celler og i mus leveren biopsier, et viktig verktøy for studiet av leverkreft. En samlet ordning av protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet er vist i figur 1.
Heri har vi gitt en komplett og detaljert beskrivelse av metodikken rapporterer bruk av SUBEs for berikelse, isolering og identifisering og karakterisering av SUMOylated proteiner i in vivo modeller av leverkreft. Både i mus leversvulster og menneskelige hepatosarkom celler, var vi i stand til å riktig isolere og identifisere SUMOylated proteiner av interesse og til å utføre en høy gjennomstrømming karakterisering av SUMOylated proteom og interactome. Selv om syntese av SUBEs er utenfor omfanget av dette manuskriptet, for ytterligere informasjon følgende referanser bør bli sett på26. Protokollen som beskrives er rask og svært følsom, og det kritiske trinnet i protokollen inkluderer bruk av SENPs-hemmere (PR-619). I alternative, kjemiske isopeptidase hemmere som NEM (N-Ethylmaleimide) og IAA (2-Iodoacetamide) i lyseringsbuffer kan brukes, men tidligere rapporter har vist at for SUBEs protokollen, bruk av PR-619 er fordelaktig som den andre hemmere forstyrre GST binding til glutation perler20.
SUBEs er rekombinant proteiner som utgjør tandem repetisjoner av Simmer som dermed erkjenner SUMO molekyler på modifiserte proteiner med en økning i den samlede affinitet for SUMO underlag. På grunn av sin høye spesifisitet og følsomhet, er bruken av SUBEs for isolering av SUMOylated proteom fordelaktig i forhold til andre tilnærminger i litteraturen som deteksjon av Western-Blot spesifikke SUMOylated proteiner ved hjelp av antistoffer mot protein av interesse eller nikkel kromatografi ved hjelp av ulike histidin-kodede versjoner av SUMO molekyler. Det må imidlertid tas i betraktning at når SUBEs-protokollen utføres under ikke-denaturering forhold, opprettholdes samspillet mellom SUMOylated proteiner og andre samspill proteiner. Derfor får vi informasjon om SUMO-interactome i stedet for bare en liste over SUMOylated mål proteiner. Dermed ytterligere eksperimenter er nødvendig for å bekrefte om det identifiserte proteinet er et SUMO mål eller en samspill faktor. Andre begrensninger i SUBEs er det faktum at kontroll GST feller brukt er i stand til å fange opp mange bakgrunns proteiner relatert til oksidativt stress. Dette problemet er spesielt relevant under MS-analysen på grunn av høy følsomhet av teknikken. For å overkomme disse begrensningene har biotinylated SUMO-feller (bioSUBEs) blitt utviklet26. En annen begrensning av SUBEs ligger i det faktum at vi bare er i stand til å fange proteiner endret av SUMO 2 og SUMO 3 mens SUMO 1-modifiserte proteiner kan ikke isoleres.
Annen bekymring for bruken av SUBEs er relatert til mengden av Start materiale som er nødvendig for prosedyren. Start materialet som brukes til å fange SUMOylated proteiner bør vurdere de ulike eksperimentelle forholdene utforsket. Mens basal SUMOylation har blitt rapportert i ulike cellulære sammenhenger, er SUMOylation en prosess som er sterkt indusert etter flere stress forhold/stimuli. Hvis man sammenligner ubehandlede versus behandlede prøver, må man være sikker på at kolonnen ikke er mettet, og det kan observeres forskjeller mellom disse betingelsene. I tilfelle av musen fenotyper vi analyserer, ingen behandlinger har blitt brukt og basal SUMOylation nivåer er lave. Av denne grunn ble det brukt store mengder proteiner. Bakgrunns nivået bør kontrolleres ved hjelp av GST, og hvis den løs bindingen er høy, skal mengden Start materiale eller bindingstid reduseres. Analysen av FT brøk kan tyde på fangst effektivitet selv om disse fellene foretrekker Poly-SUMOylated proteiner og en total tømming bør ikke forventes, en reduksjon av totale SUMOylation er generelt godt observert når fangst effektivitet er Optimal.
Til slutt, andre anvendelsen av SUBEs teknologien inkluderer kombinasjonen av SUBEs teknologi med Real-Time Surface Plasmon resonans (SPR) slik at sanntids interaksjon med SUMOylated proteiner fra celle ekstrakter27. Også mer nylig, biotinylated SUMO-feller (bioSUBEs) har blitt utviklet med den fordel å redusere bakgrunnen knyttet til større koder, for eksempel under masse massespektrometri analyse26. I tillegg kan den bioSUBE versjonen brukes til å oppdage SUMOylated proteiner i levende celler ved fluorescens ved hjelp av streptavidin-merket med distinkte fluorescerende fargestoffer utnytter streptavidin binding til biotin. Også metoder for påvisning og kvantifisering av SUMOylated proteiner kan betraktes med både GST og bioSUBEs versjoner som det ble gjort med tandem ubiquitin bindende enheter (rør)21.
Samlet, bruk av SUBEs for isolering og karakterisering av SUMOylated proteom relevant i leverkreft er en rask og følsom metode som gir enorm informasjon om fortsatt ganske ukjent rolle SUMOylation veien i leverkreft.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Institut National du Cancer, Frankrike, INCa Grant PLBIO16-251 (PLBIO16-251), CONACyT-SRE (Mexico) Grant 0280365 og REPERE program for Occitanie, Frankrike (M.S.R.). Også NIH (US Department of Health and Human Services)-R01AR001576-11A1, Gobierno Vasco-Departamento de salud 2013111114 (til M.L.M.-C), ELKARTEK 2016, Departamento de Industria del Gobierno Vasco, MINECO: SAF2017-87301-R integrado en El plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Differensialaksen 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER, BIOEF (baskisk stiftelse for innovasjon og helse forskning): EITBS Maratoia BIO15/CA/014; Instituto de salud Carlos III: PIE14/00031, integrado en El plan Estatal de Investigación Cientifica y Técnica y Differensialaksen 2013-2016 cofinanciado con fondos FEDER (til M.L.M.-C), Asociación Española Contra el Cáncer (T. C. D, M. L. M-C), Daniel Alagille Award fra EASL (til T. C. D), Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cancer (AECC Scientific Foundation) sjelden tumor samtaler 2017 (til M. L. M), La Caixa Foundation program (til M. L. M). Vi takker MINECO for Severo Ochoa Excellence akkreditering til CIC bioGUNE (SEV-2016-0644).
(Gnmt−/−)/ (Gnmt+/+) mice | CIC bioGUNE | ||
0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
BEBM | Lonza/Clonetics Corporation | cc-3171 | |
BEGM Bullet Kit | Lonza/Clonetics Corporation | CC3170 | |
Bromophenol blue | Sigma | 115-39-9 | |
BSA | Sigma | A4503 | |
C18 microcolumns | Millipore | Z720070 | |
Collagen type I | Santa Cruz Biotechnology | sc-136157 | |
Complete tablets EDTA-free | Roche | 4693132001 | |
DMEM | Life Technologies | A14431-01 | |
DTT | Sigma | 43815 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
EGF | Sigma | e9644 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
Fibronectin | Life Technologies | 33010018 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Glutathione agarose beads | Sigma | G4510 | |
Glycerol | Sigma | G5516 | |
GST-Control | SignalChem | G52-30H | |
GST-SUBEs | SignalChem | S291-340G | |
Huh7 | CLS (Cell Lines Service) | 300156 | https://clsgmbh.de/ |
IAA (2-Iodoacetamide) | Merck | L58046844 | |
LKB1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32245 | |
Mini LabRoller Rotator | LABNET | H5500 | https://www.labnetinternational.com |
NaCl | Merck | 106404041000 | |
nanoElute | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
NEM (N-Ethylmaleimide) | Sigma | E3876 | |
NP40 | Fluka | 74385 | |
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Peaks software | Bioinformatics Solutions Inc. | http://www.bioinfor.com/ | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 | |
PR-619 | Merck | 662141 | |
Precellys 24 | Bertin Technologies | P000669-PR240-A | |
PSA | Life Technologies | 151-40-122 | |
PSG | Life Technologies | 10378-016 | |
SDS | Sigma | L3771 | |
SUMO2/3 antibody | Abcam | Ab3742 | |
THLE-2 | ATCC | ATCC CRL-2706 | http://www.lgcstandards-atcc.org |
timsTOF Pro with PASEF mass spectrometer | BRUKER | https://www.bruker.com/ | |
β-mercaptoethanol | Sigma | 60-24-2 |