JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Jon mobilitet-masspektrometri tekniker för att bestämma strukturen och mekanismerna för metall Jon igenkänning och redox aktivitet av metall bindning Oligopeptides

Published: September 07, 2019
doi:
10.3791/60102
, , , ,
1Department of Chemistry,Texas A&M University-Commerce

Summary

Jon mobilitet-masspektrometri och molekylära modelleringstekniker kan karakterisera den selektiva metallkelaterande prestandan hos designade metallbindande peptider och den kopparbindande peptiden methanobactin. Utveckla nya klasser av metallkelerande peptider kommer att bidra till att leda till Therapeutics för sjukdomar som förknippas med metall Jon obalans.

Abstract

Elektrospray jonisering (ESI) kan överföra en vatten-fas peptid eller peptid komplex till gas-fas samtidigt bevara sin massa, total laddning, metall-bindande interaktioner, och kon Formations form. Koppling ESI med Jon mobilitet-masspektrometri (im-MS) ger en instrumentell teknik som möjliggör samtidig mätning av en peptid Mass-to-Charge (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) som relaterar till dess stökiometri, protonering tillstånd, och kon Formations form. Den totala laddningen av en peptid komplex styrs av protonationen av 1) peptidens sura och grundläggande platser och 2) oxidationstillståndet hos metall Jon (er). Därför, den totala laddningsstatus för ett komplex är en funktion av pH i lösningen som påverkar peptider metall jonbindning tillhörighet. För ESI-IM-MS-analyser bereds lösningar av peptid-och metalljoner från vattenlösningar med pH-värdet justerat med utspädd, vattenbaserad ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta möjliggör pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för en specifik peptid. Dessutom kan m/z och CCS av en peptid komplex användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att urskilja bindningsställen av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. Resultaten visar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning alternativa methanobactin peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid methanobactin.

Introduction

Koppar och zink joner är viktiga för levande organismer och avgörande för processer inklusive oxidativ skydd, vävnad tillväxt, andning, kolesterol, glukosmetabolism, och genomläsning1. För att möjliggöra dessa funktioner, grupper som thiolate av CYS, Imidazol av hans2,3, (mer sällan) tioeterlänken av metionin, och karboxylat av GLU och ASP införliva selektivt metaller som kofaktorer i den aktiva platser av metalloenzymer. Likheten mellan dessa samordningsgrupper väcker en spännande fråga om hur hans och CYS ligander selektivt införliva antingen Cu (I/II) eller Zn (II) för att säkerställa korrekt funktion.

Selektiv bindning sker ofta genom förvärv och människohandel peptider, som kontrollerar Zn (II) eller Cu (I/II) jonkoncentrationer4. Cu (I/II) är mycket reaktiv och orsakar oxidativ skada eller oavsiktlig bindning till enzymer, så dess fria koncentration är tätt reglerad av koppar Chaperones och koppar reglerande proteiner som transporterar det säkert till olika platser i cellen och tätt kontrollera dess homeostas5,6. Störningar av kopparmetabolism eller homeostas är direkt inblandad i Menkes och Wilsons sjukdom7 samt cancer7 och neurala sjukdomar, såsom prionsjukdomar8 och Alzheimers sjukdom9.

Wilsons sjukdom är förknippad med ökade koppar nivåer i ögonen, levern och delar av hjärnan, där redoxreaktionerna av Cu (I/II) producerar reaktiva syreradikaler, orsakar hepatolentikulär och neurologiska degeneration. Befintliga kelering terapier är den lilla tiol aminosyran penicillamin och trietylenetetramine. Alternativt, den methanotrophic koppar-förvärv peptider methanobactin (MB)10,11 uppvisar terapeutisk potential på grund av deras hög bindning affinitet för Cu (I)12. När methanobactin (MB-OB3b) från Methylosinus trichosporium OB3b studerades i ett djurmodell av Wilsons sjukdom, koppar effektivt bort från levern och utsöndras genom galla13. In vitro-experiment bekräftade att MB-OB3b kunde kelat koppar från kopparmetallothionein som finns i levern Cytosol13. Laser ablation induktivt kopplade plasma masspektrometri Imaging tekniker har undersökt den rumsliga distributionen av koppar i Wilsons sjukdom leverprover14,15,16 och visade att MB-OB3b tar bort koppar med korta behandlingsperioder på endast 8 dagar17.

Den MB-OB3b kommer också att binda med andra metalljoner, inklusive AG (I), au (III), PB (II), mn (II), Co (II), Fe (II), ni (II), och Zn (II)18,19. Konkurrensen om den fysiologiska Cu (I) bindningsstället ställs ut av AG (I) eftersom den kan tränga undan Cu (I) från MB-OB3b-komplexet, med både AG (I) och ni (II) som också visar oåterkallelig bindning till MB som inte kan förskjutas av Cu (I)19. Nyligen har en rad alternativa methanobactin (amb) oligopeptider med 2his-2cys bindande motiv har studerats20,21, och deras Zn (II) och Cu (I/II) bindningsegenskaper kännetecknas. Deras primära aminosyresekvenser är likartade, och alla innehåller 2His-2Cys motiv, Pro och en Acetylerad N-Terminus. De skiljer sig främst från MB-OB3b eftersom 2His-2Cys motiv ersätter de två enethiol oxazolon bindningsställen av MB-OB3b.

Elektrospray jonisering tillsammans med Jon Mobility-masspektrometri (ESI-IM-MS) ger en kraftfull instrumentell teknik för att bestämma metallbindande egenskaper peptider eftersom det mäter deras massa-till-laddning (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) samtidigt som de bevara sin massa, laddning och kon Formations form från lösningsfasen. M/z och CCS relaterar till peptider stoichiometry, protonering State, och kon Formations form. Stökiometrin bestäms på grund av att identiteten och numret för varje beståndsdel som finns i arten är tydligt identifierade. Den totala laddningen av peptidkomplexet relaterar till protonationstillståndet för de sura och grundläggande platserna och oxidationstillståndet hos metall Jon (s). CCS ger information om den kon Formations form av peptid komplex eftersom den mäter den rotations genomsnittliga storleken som hänför sig till den tertiära strukturen av komplexet. Den totala laddningstillstånd av komplexet är också en funktion av pH och påverkar peptiden metall jonbindning tillhörighet eftersom deprotonerade grundläggande eller sura områden såsom karboxyl, hans, Cys och Tyr är också de potentiella bindningsställen för metall Jon. För analyserna bereds peptiden och metall Jon lösningen i vattenlösningar med pH-värdet justerat genom utspädd vatten ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta gör det möjligt för pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för peptiden. Dessutom, m/z och CCS bestäms av ESI-im-MS kan användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att upptäcka vilken typ av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. De resultat som visas i denna artikel avslöjar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning av amb peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid MB-OB3b.

Protocol

1. beredning av reagenser Kultur methylosinus trichosporium OB3b, isolera Cu (I)-gratis MB-OB3b18,22,23, frys-torka provet och förvara vid-80 ° c fram till användning. Syntetisera amb peptider (> 98% renhet för amb1, amb2, amb4; > 70% renhet för amb7), frys-torka proverna, och förvara dem vid-80 ° c tills användning. Inköp > 98% renhetsgr…

Representative Results

Metall bindning av amb1IM-MS studie20 av amb1 (figur 1a) visade att både koppar och zink joner bundet till amb1 på ett pH-beroende sätt (figur 2). Men koppar och zink bundet till amb1 genom olika reaktionsmekanismer på olika samordnings platser. Till exempel, lägga Cu (II) till amb1 resulterade i oxidation av amb1 (amb1ox</sub…

Discussion

Kritiska steg: bevara lösnings fas beteenden för undersökning via ESI-IM-MS
Native ESI instrumentella inställningar måste användas som bevarar peptiderna stoichiometry, laddningstillstånd, och överensstämde struktur. För inhemska förhållanden måste villkoren i ESI-källan såsom kon spänningar, temperaturer och gasflöden optimeras. Också, trycket och spänningar i källan, fälla, Jon rörlighet, och överföra resande vågor (särskilt DC trap bias som styr insprutnings spänningen i …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under 1764436, NSF instrument support (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014), och datorresurser från Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) och L3 Communications . Vi tackar Bower grupp University of California-Santa Barbara för att dela Sigma-programmet och Ayobami Ilesanmi för att demonstrera tekniken i videon.

Materials

acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, &. #. 1. 9. 3. ;. Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116, 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson’s disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson’s disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson’s disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility – mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. . Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

Tags

Ion Mobility-mass SpectrometryIM-MSMetal Ion RecognitionRedox ActivityMetal Binding OligopeptidesMolecular ModelingTertiary StructureMetal CorrelationESI-IM-MSPoly-DL-alanineAlternative MethanobactinPH-dependent RedoxMethyl Binding ReactionProduct IonsStoichiometryProtonation StateConformational StructureMetal Chelating PeptidesTherapeuticsMenkes DiseaseWilson’s DiseaseCancerAlzheimer’s DiseaseNative ESI-IM-MSNegative IonPositive IonAcetic AcidAmmonium HydroxideMass-to-chargeIsotope Pattern

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image