将DNA微注射到异种胚胎的眼蕾中，以及GFP表达光学轴状轴向轴向的成像，活的Xenopus大白鼠
Summary
该协议旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物微注射到一天长的Xenopus laevis胚胎的眼蕾中，以及如何在中脑中图像和重建单个绿色荧光蛋白（GFP），表达光学轴向轴向。完好无损，活着的Xenopus小动物。
Abstract
水生蛙类的子群的主要视觉投影是研究调节神经元连通性发展的机制的一个很好的模型系统。在建立视网膜-tecto期间，视斧子从眼睛延伸，穿过大脑的不同区域，到达它们的目标组织，即视道。一旦光学轴突进入技术，他们精心设计终端树干，功能增加突触连接的数量，他们可以与目标内神经元在技术。在这里，我们描述了一种表达DNA编码绿色荧光蛋白（GFP）的方法，以及Xenopus胚胎中的视神经（视网膜神经结条细胞）中的增益和功能丧失基因构造。我们解释如何将联合DNA/唇裂试剂显微注入一天老胚胎的眼蕾中，以便外源基因在单个或多个视神经元中表达。通过用GFP标记基因或用GFP质粒共同注入基因，具有改变分子信号的单个光学神经元的终端轴状轴状可以直接在几天后完整、活的Xenopus小虫的大脑中成像，以及它们的形态可以量化。该协议允许确定细胞自主的分子机制，这是在体内发展光学轴向的。
Introduction
在神经系统发育过程中，前突触神经元的斧子通过大脑的不同区域导航，到达目标区域。当斧突子侵入其目标组织时，它们与午睡后目标神经元建立突触连接。在许多类型的神经元中，轴突通过阐述终端分支或轴1的网络来增加它们可以建立突触连接的数量和空间范围。水生蛙Xenopus laevis的胸腔-tec-tect-tecta是一个强大的脊椎动物模型，用于检查终端轴突化和突触连接2、3、4的原理。.单个GFP表达光学轴状轴向与正常和改变的分子信号可以直接观察到在完整，活的Xenopus小动物5，6，7，8。为了单独表达GFP，或与少量视神经中全长或截断基因一起表达基因，我们使用一种技术，将DNA微注射/脂肪插入一天长Xenopus胚胎9的眼蕾中。10.这项技术最初是为研究幼代黄鼠狼的视性斧头路径发现机制而开发的，此后我们和其他人一直应用来确定视斧头背后的细胞自主分子机制在Xenopus的植树5，6，7，8，9，10。
其他模型物种以及X.laevis中已经发展了在少数光学神经元中表达外源基因的替代技术。然而，与在异种胚胎眼蕾中微注射DNA/利普菲试剂相比，这些方法中的每一个都带来了挑战和限制。在小鼠中，转基因可用于表达少数视神经中的基因，但转基因小鼠的生成成本高昂且耗时，转基因小鼠往往存在不良的副作用11。在视神经中表达外源基因的转基因斑马鱼也可以通过将质粒注射到早期裂解阶段胚胎12中产生。然而，这个过程需要克隆一个特定的启动子来表达在斑马鱼幼虫12的视神经的马赛克模式的基因。转基因斑马鱼视神经中外源DNA的表达频率也较低（<30%）与用DNA/脂质体试剂（30~60%）进行微注射的Xenopus小黄鼠相比，12。在ovo电穿孔也被用来表达基因在少量的光学神经元在小鸡13。然而，这个程序未能完全描述建立光学投影的机制，因为光学轴向轴向化不能在完整、活的小鸡胚胎中成像。最后，几个实验室已经利用电穿孔将基因转染成少量的视神经，在Xenopus 14，15。然而，电穿孔需要优化设备和方案（刺激器、电极、波脉冲的空间和时间模式），而用于将DNA/利普菲试剂微注射到Xenopus胚胎眼蕾中。
我们和其他人以前使用微注射/脂肪技术将DNA注入到Xenopus胚胎的眼蕾中，以确定细胞自主信号机制，建立视轴向化5，6，7,8.我们最初用这种方法来剖析在异种小球5、6的视轴向化中，Cadherin和Wnt适配器蛋白β-卡泰宁的功能。在一项研究中，我们表明，β-卡腾宁结合到β-卡腾宁和PDZ分别需要启动和塑造体内的视轴非子树。在第二份报告中，我们演示了β-卡泰宁和葛兰素-3+的β-卡泰宁结合域对腹腔光学轴向6的投影模式进行了反向调节。最近，我们确定了Wnt因子，腺瘤大肠杆菌（APC）的作用，在调节在Xenopus小虫7的视轴状树的形态特征。通过共同表达APC的N-终端和中心域，在单个光神经元中与GFP一起调节β-卡泰宁稳定性和微管组织，我们确定了这些APC交互域在分支编号上的共享和不同作用，长度，和角度在光学轴向轴向在体内7。另一个实验室使用显微注射/利福菲化技术来确定BDNF受体TrkB在Xenopus 8的光学轴状轴状中发出信号的细胞自主作用。该组显示，在体内8的个体光学轴突合中，显性阴性TrkB扰动分枝和突触成熟。总体而言，Xenopus的脂质化技术已经阐明了不同基因在原生环境中视斧子分枝中的具体作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，我们演示了如何在单或少量光学神经元中表达外源性DNA构造，以及如何在青蛙X的完整、活的带状的带正常和改变的分子信号中成像单个GFP表达的光学轴向轴向。 .拉维斯.我们还解释了如何从体内捕获的图像中重建和量化 GFP 表达光学轴轴的树的形态。为了在少量视神经元中表达外源性DNA质粒，我们用克里斯汀·霍尔特实验室首次开发的技术，将DNA/利普菲反应试剂混合物微注射到?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢图罗大学加州骨病医学学院对我们的研究的支持。我们感谢以前在实验室里的学生（吴先生、彭先生、金泰根、林约翰），他们在我们的实验室里帮助实施了这种显微注射技术。我们感谢克里斯蒂娜·霍尔特博士，他的实验室首次开发了Xenopus胚胎的DNA微注射/唇分技术。
Materials
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 – G/X | |
| μ-manager software (Version ) | www.micro-manager.org | ||
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20X/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| Image J (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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