カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

サマリー

ここでは、堅牢なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を一貫して生成し、その機能を特徴付ける方法を記述し、検証する。これらの技術は、シグナル伝達経路に対する機械的洞察を開発するのに役立ち、大規模な薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供し、心臓疾患を確実にモデル化する。

要約

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、カルシウム^(Ca2+)の取り扱いとシグナル伝達経路の基礎科学、ならびに高スループット薬物スクリーニングおよび毒性アッセイを研究するための貴重なヒト源を提供する。ここでは、異なる細胞株間で分子的および機能的特性を一貫して再現できる高品質なiPSC-CMを生成するために使用される方法論について詳しく説明する。さらに^、Ca2+処理特性の評価を通じて、その機能特性を確実に評価する方法について説明する。低酸素_(O2)条件、乳酸選択、培養時間の延長は、高純度で高品質な心室様心筋細胞を産生する。孤立した成人ラット心筋細胞(ARCM)と同様に、3ヶ月齢のiPSC-CMは、より高い^Ca2+振幅^、Ca2+再取り込み(減衰タウ)の速い速度、および30日目のiPSC-CMと比較してβアドレナリン刺激に対する陽性の潤滑反応を示す。この戦略は、技術的にシンプルで費用対効果が高く、再現可能です。それは心疾患をモデル化し、Ca²⁺処理タンパク質を標的とする大規模な薬物スクリーニングのための強いプラットホームを提供する。

概要

ヒト誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、インビトロ^{1、2、3、4、5、6、7、7、8}で多種多様な心疾患をモデル化する魅力的なヒトベースのプラットフォームである。さらに、iPSC-CMは、新規または既存の薬剤に対する患者応答の予測、ヒット化合物のスクリーニング、および新しいパーソナライズされた薬剤^9、10の開発に使用することができる。ただし、大幅な進歩にもかかわらず、iPSC-CM¹¹を使用する場合は、いくつかの制限と課題を考慮する必要があります。その結果、心臓分化プロトコルを改善し、iPSC-CMの効率および成熟を高め、および特定の心筋細胞サブタイプ(心室、心房、および節点)を生成する方法は、強く研究され、すでにこれらのハー....

プロトコル

本研究では、成人ラット心筋細胞を用いた実験は、シナイ山のイカーン医科大学の認可された動物ケア・利用委員会(IACUC)プロトコルを用いて行われた。成人ラット心筋細胞は、先に説明した^16.ランゲンドルフベースの方法によりスプレイグ・ドーリーラット心臓から単離された。

1. メディアの準備

1. hiPSC メディアを準備します。
   1. サプリメントと基礎培地を室温(RT)に平衡化する。サプリメントが完全に解凍されていることを確認します。.0.22μm真空駆動フィルターを使用して、基礎媒体の400mLとサプリメントとフィルターの100 mLを混合します。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
2. RPMI + B27 を準備します。
   1. B27 サプリメントと基底媒体 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメントの10 mLを混合し、0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルタを行います。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
3. RPMI + B27 (-) インスリンを準備します。
   1. B27 (-) インスリンサプリメントと基底培地 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメン....

結果

図1に記載されたプロトコルは、培養中の時間とともに心室/成人様表現型を獲得する非常に純粋な心筋細胞を生成した。心房および心室ミオシン調節光鎖2アイソフォーム(MLC2AおよびMLC2Vそれぞれ)に対する免疫蛍光染色によって評価されたように、このプロトコルによって生成された細胞の大部分は、心臓分化の誘導後30日目にMLC2A陽性であったが、MLC2Vは同時にはるかに低い量で発現した(図2、トップパネル)。培養時間が長くなるにつれて(60日目と90日目)、MLC2アイソフォーム(MLC2A~MLC2V)の完全なスイッチが観察された(図2A、底部パネル)。MLC2AおよびMLC2V陽性細胞を定量するために、フローサイトメトリー分析を行った。免疫蛍光結果に従って、フローサイトメトリーデータは、主にMLC2A(29.8%MLC2A+対)を発現する初期段階(30日目)iP.......

ディスカッション

ヒトiPSC-CMを実験モデルとして使用するための重要なステップは:1)一貫した性能と再現性の高い結果を保証できる高品質の心筋細胞(CM)を生成する。2)細胞が少なくとも90日間培養中に成熟し、その表現型を十分に評価することを可能にする。3)電気生理学的研究を行い、例えばカルシウム^(Ca2+)過渡測定を行い、ヒトiPSC-CMの生理学的に関連する機能特性を提供する。高品質な心室状iPSC-CMを生み出す単層ベースの分化法を開発しました。私たちの方法は、いくつかの重要な要因に依存し、既存のプロトコル^14、18の変種です。他のプロトコルとは異なり、これはiPSCメンテナンスだけでなく、CMへの彼らの分化の最初の週の間に低酸素条件_(5%O2)を使用し、酸素の低レベルは胚および胎児の心臓発達中の環境状態を模倣する^19。低酸素状態はまた、iPSCの増殖とその後の^CM20への分化を増加することが.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンチアクチン、平滑筋抗体、マウスモノクローナル	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 ヤギ抗ウサギ	Invitrogen	A21428
B27 サプリメント	Gibco	17504-044
B27(-) インスリンサプリメント	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI 核染色	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
ダブルエンド セルリフター、フラットブレード、J-フック	セルトリート	229306
Falcon マルチウェル組織培養プレート、6 ウェル	コーニング	353046
流体インラインヒーター	ライブセル装置	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
hESC認定マトリックス	コーニング	354277	マトリゲルマトリックス
hPSC培地	Gibco	A33493-01	StemFlex 基礎培地
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
ライブセルイメージングチャンバー	生細胞装置	EC-B25
MLC-2A、モノクローナルマウス抗体	シナプス系	311011
筋細胞 カルシウムおよび収縮性系	Ionoptix	ISW-400
ミオシン軽鎖 2 抗体、ウサギポリクローナル (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow 滅菌ディスポーザブルフィルターユニット PESメンブレン	付きThermoFisher	124-0045
PBS with Calcium and Magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium	Corning	21-031-CV
Premium Glass Cover Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
L-乳酸ナトリウム	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex Supplement	Gibco	A33492-01
チアゾビビン	トクリス	3845
トリプシン-EDTA (0.25%)	サーモフィッシャー	25200056
タイロードの溶液	ボストンバイオプロダクツ	BSS-355w	pH を 7.2 に調整します。1.2mMの塩化カルシウムを添加します