फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों से Lyssavirus एंटीजन डिटेक्शन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री टेस्ट
Summary
यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों के लिए वैकल्पिक नैदानिक परीक्षण के रूप में रेबीज वायरस एंटीजन का पता लगाने के लिए एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
रेबीज के लिए प्राथमिक नैदानिक तौर-तरीकों में से एक संक्रमित ऊतक नमूनों में वायरल राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) परिसर (एंटीजन) का पता लगाना है। जबकि प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण या प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी) का उपयोग आमतौर पर एंटीजन डिटेक्शन के लिए किया जाता है, दोनों परीक्षणों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीजन डिटेक्शन से पहले स्लाइड पर इंप्रेशन के लिए ताजा और/या जमे हुए ऊतकों की आवश्यकता होती है । यदि नमूनों को एकत्र किया जाता है और फॉर्मेलिन में तय किया जाता है, तो एंटीजन डिटेक्शन के लिए न तो परीक्षण इष्टतम होता है, हालांकि, पैराफिन ब्लॉक और सेक्शनिंग में एम्बेड करने के बाद पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा परीक्षण किया जा सकता है। इस आईएचसी विधि के साथ, ऊतकों को एंटी-रेबीज एंटीबॉडी से सना हुआ होता है, वर्गों को डिपैराफिनाइज्ड किया जाता है, आंशिक प्रोटेओलिसिस या अन्य तरीकों से एंटीजन प्राप्त किया जाता है, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेटेड होता है। एंटीजन सहिजन पेरोक्सिडास/अमीनो एथिल कार्बाजोल का उपयोग करके दाग रहे हैं और हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके दृश्य के लिए हेमेटॉक्सीलिन के साथ जवाबी दाग रहे हैं। विशिष्ट एंटीजन डिटेक्शन के अलावा, फॉर्मेलिन निर्धारण हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों के निर्धारण, नमूना भंडारण और परिवहन (परिवेश के तापमान के तहत), पूर्वव्यापी मामलों का परीक्षण करने की क्षमता और संक्रामक एजेंटों की निष्क्रियता के माध्यम से बेहतर जैविक सुरक्षा जैसे अन्य फायदे प्रदान करता है।
Introduction
रेबीज एक तीव्र प्रगतिशील इंसेफेलाइटिस है जो1जीनस से संबंधित नकारात्मक भावना आरएनए वायरस के कारण होता है । रेबीज वायरस (RABV), जीनस के प्रकार के सदस्य के साथ संक्रमण की वजह से सभी मानव मौतों का लगभग ९९%, कुत्तों द्वारा प्रेषित किया जाता है2। संदिग्ध जानवरों का रेबीज निदान मस्तिष्क केऊतकोंमें जीनोमिक आरएनए (राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स, आरएनपी) के साथ जटिल में एंटीजन (मुख्य रूप से वायरल एन्कोडेड न्यूक्लियोप्रोटीन, एन प्रोटीन) का पता लगाने पर निर्भर करता है। डायरेक्ट फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (डीएफए) परीक्षण द्वारा एंटीजन डिटेक्शन को रेबीज निदान 4 के लिए स्वर्ण मानक मानाजाताहै। विधि ताजा या ताजा जमे हुए मस्तिष्क सामग्री का उपयोग करती है, एक स्लाइड पर एक स्पर्श छाप, एसीटोन में निर्धारण, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट आइसोथियोसायनेट (फिटसी) लेबल मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी/पीएब्स) लेबल का उपयोग करते हैं और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी5द्वारा पढ़ते हैं। डीएफए परीक्षण ताजा मस्तिष्क ऊतक में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट है। हाल ही में, एक प्रत्यक्ष रैपिड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल टेस्ट (डीआरआईटी), संशोधित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) तकनीक, डीएफए के प्रति इसीतरहकी संवेदनशीलता प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शित की गई थी, लेकिन दृश्य 6 के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का लाभ प्रदान करती है। जबकि डीआरआईटी में उपयोग की जाने वाली डिटेक्शन विधि आईएचसी के समान है, प्रारंभिक चरण औपचारिक रूप से निर्धारण के बाद नमूने के स्पर्श इंप्रेशन उत्पन्न करने के लिए ताजा या जमे हुए ऊतकों का उपयोग करता है।
आईएचसी पैराफिन ब्लॉक में एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतकों में विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों और प्रोटीन का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। आईएचसी ऊतक अनुभाग 7 में रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए एकस्थापितवैकल्पिक परीक्षण है। आईएचसी का उपयोग विशेष रूप से पूर्वव्यापी मामलों के निदान के लिए किया गया है, जिन्होंने रेबीज8के बोझ को निर्धारित करने के लिए न्यूरोलॉजिकल रोगों का प्रदर्शन किया । पैराफिन-एम्बेडेड फॉर्मेलिन-फिक्स्ड ऊतक कई वर्षों के बाद भी पता लगाने के लिए प्रोटीन को संरक्षित करते हैं जब परिवेश तापमान 9 पर संग्रहीतहोताहै। फॉर्मेलिन उपचार अमीनो एसिड साइड चेन को क्रॉस-लिंकिंग और फेरबदल करके प्रोटीन को संशोधित करता है, जो एपिटोप्स को एंटीबॉडी10के खिलाफ अब प्रतिक्रियाशील नहीं बना सकता है। जबकि रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए आईएचसी परीक्षण में या तो एमएबी या पीएएस शामिल है, बाद में कई एपिटोप और अलग-अलग lyssaviruses का पता लगाया जा सकता है11के रूप में लाभप्रद है।
आईएचसी में शामिल मानक कदम ऊतकों के औपचारिक निर्धारण, पैराफिन ब्लॉकों में एम्बेडिंग, ऊतकों की धारा, डिपैराफिनाइजेशन और हाइड्रेशन, एपिटोप रिकवरी, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रतिक्रियाशीलता, और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट्स का उपयोग करके विकास हैं। यह पांडुलिपि रेबीज निदान के लिए प्रोटोकॉल के विस्तृत विवरण का वर्णन करती है। रेबीज एंटीजन डिटेक्शन के लिए, अमेरिका के रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) अटलांटा, जॉर्जिया में उत्पन्न राब वी (पीएब्स) के साथ प्रतिरक्षित माउस सीरम का उपयोग बायोटिनेलेटेड एंटी-माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के संयोजन में किया जाता है। बायोटिनेलेटेड एब्स का पता स्ट्रेप्टाविडिन-सहिजन पेरोक्सिडेस (एचआरपी) कॉम्प्लेक्स के अलावा पता लगाया जाता है जिसके बाद अमीनो-एथिलकारबाजोल सब्सट्रेट के साथ रंग विकास होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लक्षण शुरुआत के बाद रेबीज की उच्च मृत्यु दर के कारण, राबव संक्रमण के लिए संदिग्ध जानवरों का निदान एक उपयुक्त पोस्ट-एक्सपोजर रोगनिरोधी उपचार के लिए बेहद महत्वपूर्ण है। रेबीज निदान मुख्य रूप से ताजा या ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों के लिए नमूना प्रस्तुतियां के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य विभागों के साथ प्रयोगशालाओं, महामारी विज्ञानियों, और सहयोगी कंपनियों का शुक्रिया अदा करते हैं । निष्कर्ष और इस रिपोर्ट में निष्कर्ष लेखकों के उन है और जरूरी रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्रों की आधिकारिक स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते । व्यापार के नाम और वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग केवल पहचान के लिए कर रहे है और रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा समर्थन मतलब नहीं है ।
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
