Immunhiistokjemi Test for Lyssavirus Antigen Deteksjon fra Formalin-fast vev
Summary
Her presenterer vi en immunhiokjemisk testprotokoll for påvisning av rabiesvirusantigen som en alternativ diagnostisk test for formalin-fast vev.
Abstract
En av de primære diagnostiske modaliteter for rabies er påvisning av viral ribonucleoprotein (RNP) kompleks (antigen) i de infiserte vevsprøvene. Mens den direkte fluorescerende antistoff (DFA) testen eller den direkte raske immunhiistokjemiske testen (DRIT) oftest brukes til antigendeteksjon, krever begge testene friskt og / eller frossent vev for inntrykk på lysbilder før antigendeteksjonen ved hjelp av antistoffer. Hvis prøver samles inn og festes i formalin, er ingen av testene optimale for antigendeteksjon, men testing kan utføres ved konvensjonell immunhiistokjemi (IHC) etter innebygging i parafinblokker og seksjonering. Med denne IHC-metoden er vev farget med anti-rabies antistoffer, seksjoner deparaffiniseres, antigen hentes ved delvis avhandling eller andre metoder, og inkuberes med primære og sekundære antistoffer. Antigener er farget ved hjelp av pepperrotperoksidase / amino etylkarbazol og motstained med hematoksylin for visualisering ved hjelp av et lett mikroskop. I tillegg til den spesifikke antigendeteksjonen, tilbyr formalinfiksering andre fordeler som bestemmelse av histologiske endringer, avslappede forhold for prøvelagring og transport (under omgivelsestemperaturer), evne til å teste retrospektive tilfeller og forbedret biologisk sikkerhet gjennom inaktivering av smittsomme midler.
Introduction
Rabies er en akutt progressiv encefalitt forårsaket av den negative sansen RNA-virus som tilhører slekten lyssavirus1. Nesten 99% av alle menneskelige dødsfall forårsaket av infeksjonen med rabiesvirus (RABV), typemedlemmet av slekten, overføres av hunder2. Rabies diagnose av mistenkte dyr er avhengig av påvisning av antigen (primært viral kodet nukleoprotein, N protein) i kompleks med genomisk RNA (ribonucleoprotein kompleks, RNP) i hjernevevet3. Antigendeteksjonen av den direkte fluorescerende antistoff (DFA) testen regnes som gullstandarden for rabiesdiagnose4. Metoden benytter ferskt eller ferskt frossent hjernemateriale, et berøringsinntrykk på et lysbilde, fiksering i aceton, farging ved hjelp av kommersielt tilgjengelig fluorescerende isothiocyanat (FITC) merket monoklonale eller polyklonale antistoffer (mAbs / pAbs) og lest av fluorescensmikroskopi5. DFA-testen er rask, følsom og spesifikk for rabies antigendeteksjon i ferskt hjernevev. Nylig ble en direkte rask immunhiistokjemisk test (DRIT), modifisert immunhiistokjemi (IHC) teknikk, demonstrert for å vise lignende følsomhet for DFA, men gir fordelen av lysmikroskopi for visualisering6. Mens deteksjonsmetoden som brukes i DRIT, ligner på IHC, bruker det første trinnet friske eller frosne vev for å generere berøringsinntrykk av prøven etterfulgt av fiksering i formalin.
IHC er en mye brukt teknikk for å bestemme histologiske endringer og påvisning av proteiner ved hjelp av spesifikke antistoffer i formalinfast vev innebygd i parafinblokker. IHC er en etablert alternativ test for rabies antigen deteksjon i vevsseksjonene7. IHC har blitt spesielt brukt til diagnostisering av retrospektive tilfeller som utviste nevrologiske sykdommer for å bestemme byrden av rabies8. Paraffin-innebygd formalin-fast vev bevarer proteinene for deteksjon selv etter flere år når de lagres ved omgivelsestemperatur9. Formalin behandling endrer proteiner ved krysskobling og endring av aminosyre sidekjeder, noe som kan gjøre epitopene ikke lenger reaktive mot antistoffer10. Mens IHC-testen for rabies antigendeteksjon innebærer enten mAbs eller pAbs, er sistnevnte fordelaktig da flere epitoper og divergerende lyssavirus kan oppdages11.
Standardtrinnene som er involvert i IHC er formalinfiksering av vev, innebygging i parafinblokker, seksjonering av vev, deparaffinisering og hydrering, epitopgjenoppretting, reaktivitet mot primære og sekundære antistoffer, og utviklingen ved hjelp av kromogene substrater. Dette manuskriptet beskriver en detaljert redegjørelse for protokollen for rabiesdiagnose. For rabies antigen deteksjon, mus serum immunisert med RABV (pAbs) generert på U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Atlanta, Georgia, i kombinasjon med biotinylerte antimus sekundære antistoffer brukes. Biotinylerte abs oppdages ved tilsetning av streptavidin-pepperrot peroksidase (HRP) kompleks etterfulgt av fargeutvikling med amino-etylcarbazol substrat.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av den høye dødelighetsraten for rabies etter symptomstart, er diagnosen mistenkte dyr for RABV-infeksjon ekstremt kritisk for en passende profylaktisk behandling etter eksponering. Rabiesdiagnosen avhenger hovedsakelig av DFA-, DRIT- og PCR-baserte teknikker ved hjelp av ferskt eller frossent vev. For testing av formalinfast vev gir IHC-testen en alternativ metode for sensitiv og spesifikk påvisning av RABV-antigen. Mens vevet som er festet i formalin har proteiner stabilisert på grunn av modifikasjon av s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker arbeiderne, epidemiologene og tilknyttede selskaper i folkehelseavdelingene for eksempelinnsendinger til Centers for Disease Control and Prevention. Funnene og konklusjonene i denne rapporten er forfatternes og representerer ikke nødvendigvis den offisielle stillingen til Centers for Disease Control and Prevention. Bruk av varenavn og kommersielle kilder er kun til identifikasjon og innebærer ikke godkjenning fra Centers for Disease Control and Prevention.
Materials
| 3% hydrogen peroxide | Pharamacy brands | Off the shelf 3% H2O2 | |
| 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) | Millipore Sigma | A6926 | |
| Acetate Buffer pH 5.2 | Poly Scientific R&D Corp. | s140 | |
| Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered | Fisher Scientific | SF100-4 | Certified |
| Cover slips Corning | Fisher Scientific | 12-553-471 | 24 X 50 mm |
| Ethanol 190 Proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol 200 Proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Gill's hematoxylin formulation #2 | Fisher Scientific | CS401-1D | |
| HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit | seracare | 71-00-18 | Mouse Primary Antibody |
| ImmunoHistoMount | Millipore Sigma | i1161 | Mounting media |
| N,N, Dimethyl formamide GR | Fisher Scientific | D119 | |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | RR14440.01 | 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6) |
| Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective | Multiple vendors | ||
| Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective | Multiple vendors | ||
| Pronase | Millipore Sigma | 53702 | Protease, Streptomyces griseus |
| Scott's Tap Water | Poly Scientific R&D Corp. | s1887 | |
| Tissue-Tek Slide stain set | Fisher Scientific | 50-294-72 | |
| TWEEN-80 | Millipore Sigma | P1754 | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | Histological Grade |
| Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope | Multiple vendors |
References
- Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184 (2017).
- Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
- Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
- WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1 (2018).
- Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
- Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
- Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
- Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
- Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
- Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
- Manning, S. E., et al. Human rabies prevention–United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
- WHO. . Laboratory techniques in rabies. 1, 67-72 (2018).
- Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
- Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
- WHO. . Diagnostic procedures for antigen detection. , (2016).
- Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).
