거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부
Summary
여기서, 우리는 감염된 아메바의 분리를 위한 단일 세포 마이크로 흡인 방법을 기술한다. 파우스토바이러스와 알려지지 않은 거대 바이러스에 감염된 Vermamoeba vermiformis의 바이러스 하위 집단을 분리하기 위해, 우리는 아래에 자세히 설명된 프로토콜을 개발하고 두 개의 저풍부 신규 거대 바이러스를 분리하는 능력을 입증했습니다.
Abstract
아메바 공동 배양 과정 동안, 하나 이상의 바이러스가 단일 웰에서 단리될 수 있다. 우리는 이전에 바이러스 집단에 적용된 종점 희석 및/또는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 이 문제를 해결했습니다. 그러나 혼합물의 바이러스가 유사한 형태학적 특성을 가지고 있고 바이러스 중 하나가 천천히 증식하면 게놈 조립 단계에서 두 바이러스의 존재가 발견되고 바이러스가 추가 특성화를 위해 분리 될 수 없습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 매우 유사한 바이러스의 분리 및 복제를 허용하는 단일 세포 마이크로 흡인 절차를 개발했습니다. 본 작품에서, 우리는 이 대체 전략이 어떻게 우리가 Clandestinovirus ST1와 Usurpativirus LCD7의 작은 바이러스성 소집단을 분리하는 것을 허용하는지, 천천히 성장하고 용해 및 급속하게 성장하는 것에 비해 아메발 용해로 이끌어 내지 않는 거대한 바이러스를 제시합니다 파우스토바이러스. 순도 대조군은 특정 유전자 증폭에 의해 평가되었고 바이러스는 추가적인 특성화를 위해 생산되었다.
Introduction
핵세포질 대형 DNA 바이러스 (NCLDV)는 진핵생물1을감염시키는 4개의 가족에 의해 정의된 극단적으로 다양합니다. 300 kbp 이상의 게놈을 가진 제1기 바이러스는 파라메치움 부르사리아 클로렐라 바이러스 1 PBCV12를포함하는 Phydcodnaviridae이었다. Mimivirus의 격리 및 첫 번째 설명은, 입자의 크기(450 nm)와 게놈(1.2 Mb)의 길이 모두에서 바이러스의 크기가 두 배로 증가한다는 것을 보여주었다3. 그 이후로, 많은 거대한 바이러스는 아메바 공동 배양 절차를 사용하여 일반적으로 격리, 설명되었다. 상이한 형태와 유전적 내용을 가진 몇몇 거대한 바이러스는 마르세유바이러스, 판도라바이러스, 피토바이러스, 몰리바이러스, 세드라트바이러스, 팩만바이러스, 투판바이러스, 및 최근 을 포함하는 세포로부터 분리될 수 있다. 메두사 바이러스4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. 이와 병행하여, Vermamoeba vermiformis의 격리는 파우스토바이러스, 카우모에바바이러스 및 오르페오바이러스18,19,20의분리 및 설명을 허용했다. 다른 거대 바이러스는 카페테리아 로엔텐시스21, 아우레오코커스 아노파페렌스22, 크리소크로물리나 에리시나23,보도 살탄과 같은 호스트 프로티스트와 함께 분리되었다. 24. 이러한 모든 격리는 격리 작업 팀의 증가와 높은 처리량 전략 업데이트의 도입의 결과였다25,26,27,28, 유세포분석의 사용과 함께 공동 배양 시스템의 개선.
2016년에는 거대 바이러스27을분리하기 위해 공동 배양 및 유세포 분석과 연계전략을 사용했습니다. 이 전략은 접종된 샘플의 수를 늘리고, 세포 지원으로 사용되는 프로티스트를 다양화하고, 세포 지지체의 용해를 신속하게 검출하기 위해 개발되었습니다. 이 시스템은 Pacmanvirus29의경우와 같이 예비 분자 생물학 식별 및 알 수없는 바이러스 집단의 빠른 검출을 피하기 위한 추가 단계를 추가하여 업데이트되었습니다. 미미바이러스와 세드라트바이러스 A1130의혼합물을 분리할 수 있도록 세포 선별에 유동 세포분석. 그러나, 우리는 나중에 유세포측정에 의한 이러한 바이러스 성 하위 집단의 분리 및 검출의 한계를 만났다. 시퀀싱 후, 우리는 Faustovirus ST125 및 Faustovirus LCD7 (미공개 데이터)의 게놈을 조립할 때, 우리는 놀랍게도 공공 게놈 데이터베이스에서 확인되지 않은 두 개의 새로운 바이러스의 두 개의 보충 게놈을 각 어셈블리에서 발견했습니다. 그러나, 유동 세포분석이나 투과 전자 현미경 검사법(TEM)은 아메바에가 두 가지 다른 바이러스인 클렌데스티노바이러스 ST1 및 우스르파티바이러스 LCD7에 감염된 것으로 나타났다. 우리는 그들의 게놈에 근거를 둔 파우스토바이러스, 우스르파티바이러스 및 클라데스티노바이러스 마커를 각각 증폭하기 위하여 특정 PCR 시스템을 설계했습니다; 우리의 목적은 분리되는 바이러스의 순도의 검증을 가능하게 하는 PCR 기반 시스템을 가지고 있었습니다. 그러나, 종점 희석 및 유세포세포는 이를 분리하지 못했다. 이 단 하나 바이러스성 인구의 고립은 Clandestinovirus와 Usurpativirus 인구의 형태 또는 복제 요소도 특징적이지 않았기 때문에 어려웠습니다. 우리는 두 집단의 중첩으로 인해 유동 세포측정에 의해 하나의 바이러스 집단을 검출했습니다 (효과적인 분리 후에 테스트). 우리는 96 웰 플레이트에 단일 입자 선별을 사용하여 그들을 분리하려고했지만, 우리는 어떤 세포 병증 효과를 관찰하지 않았다, 우리는 CLANDESTinovirus도 PCR 증폭에 의해 Usurpativirus를 감지하지 않았다. 마지막으로, 파우스토바이러스로부터 이 두 개의 저급한 거대 바이러스를 분리할 수 있게 한 것은 단 하나의 아메바 마이크로 포부에 이어 종점 희석의 조합일 뿐이었다. 이 분리 방법은 이 문서의 대상입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 셀 마이크로 흡인 처리의 지속 시간과 그 양호한 기능은 연산자 의존적입니다. 실험의 다른 단계에는 정밀도가 필요합니다. 워크스테이션의 미세 조작 성분의 사용은 마이크로 흡인 의 과정과 세포의 방출을 관찰하여 일정한 제어를 받아야합니다. 현미경 관찰에 의한 후속 조치는 세포의 포획 및 전달에 필요합니다. 숙련된 작업자는 10개의 세포를 분리하고 격리할 바이러스의 풍부에 따라 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 장 피에르 바우도인과 올리비에 음바렉에게 조언을 해준 장 피에르 바우도인과 클레어 안드레아니에게 영어 수정과 수정에 도움을 준 것에 대해 감사를 표하고 싶다. 이 작품은 참조 ANR-10-IAHU-03 (메디테라네 감염) 및 레지온 프로방스 알프스에 의해 “투자 d’avenir (미래를위한 투자)”프로그램에 따라 국립 연구 기관에 의해 관리 프랑스 국가에서 보조금에 의해 지원되었다 코트 다쥐르와 유럽 자금 조달 페더 프리미.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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