विशालकाय वायरस मिश्रण पृथक्करण के लिए फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के लिए एक वैकल्पिक रणनीति के रूप में एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा
Summary
यहाँ, हम संक्रमित अमीबा के पृथक्करण के लिए एकल कोशिका सूक्ष्म-आकांक्षा विधि का वर्णन करते हैं। Faustoviruses और अज्ञात विशाल वायरस से संक्रमित Vermaiba वर्मीफॉर्मिस में वायरल subpopulations अलग करने के लिए, हम नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित की है और दो कम बहुतायत उपन्यास विशाल वायरस अलग करने की क्षमता का प्रदर्शन किया।
Abstract
अमीबा सह-संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, एक से अधिक वायरस एक ही कुएं में अलग-थलग हो सकते हैं। हम पहले अंत बिंदु कमजोर पड़ने और / या फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) वायरल आबादी के लिए लागू द्वारा इस मुद्दे को हल किया. हालांकि, जब मिश्रण में वायरस समान morphologic गुण है और वायरस में से एक धीरे धीरे गुणा, दो वायरस की उपस्थिति जीनोम विधानसभा के चरण में की खोज की है और वायरस आगे विशेषता के लिए अलग नहीं किया जा सकता है. इस समस्या को हल करने के लिए, हम एक एकल सेल सूक्ष्म आकांक्षा प्रक्रिया है कि जुदाई और अत्यधिक इसी तरह के वायरस की क्लोनिंग के लिए अनुमति देता है विकसित की है. वर्तमान काम में, हम वर्तमान कैसे इस वैकल्पिक रणनीति हमें Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 के छोटे वायरल subpopulations अलग करने की अनुमति दी, विशाल वायरस है कि धीरे धीरे बढ़ने और lytic और तेजी से बढ़ने की तुलना में अमीबल lysis के लिए नेतृत्व नहीं करते Faustovirus. पवित्रता नियंत्रण विशिष्ट जीन प्रवर्धन द्वारा मूल्यांकन किया गया था और वायरस आगे विशेषता के लिए उत्पादन किया गया.
Introduction
न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बड़े डीएनए वायरस (NCLDV) अत्यंत विविध हैं, चार परिवारों द्वारा परिभाषित किया गया है जो यूकैरियोट1को संक्रमित करते हैं। पहले 300 केबीबीपी से ऊपर जीनोम वाले वायरस फिडकोडनविरीडीथे , जिनमें पैरामीशियम बर्सेरिया क्लोरेला वायरस 1 पीबीवीवी 12शामिल था . अलगाव और मिमीवायरस के पहले विवरण से पता चला है कि कण के आकार (450 एनएम) और जीनोम (1.2 एमबी)3दोनों के संदर्भ में वायरस का आकार दोगुना हो गया। तब से, कई विशाल वायरस वर्णित किया गया है, आमतौर पर एक अमीबा सह संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग कर अलग. विभिन्न morphologies और आनुवंशिक सामग्री के साथ कई विशाल वायरस Acanthamoeba sp. कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, मार्सिलेवायरस, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus सहित, और हाल ही में मेडुसा वायरस4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. समानांतर में, Vermaba वर्मीफॉर्मिस के अलगाव और विशाल वायरस Faustovirus, Kaumoebavirus, और Orpheovirus18,19,20के विवरण की अनुमति दी. अन्य विशाल वायरस उनके मेजबान protists के साथ अलग थे, जैसे कैफेटेरिया roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina एरिकिना23, और बोडो लवण 24. इन अलगावों के सभी अलगाव पर काम कर रहे टीमों की बढ़ती संख्या का परिणाम था और उच्च थ्रूपुट रणनीति अद्यतन25,26,27,28जैसे प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग के साथ सह-संस्कृति प्रणाली में सुधार।
2016 में, हमने विशाल वायरस27को अलग करने के लिए सह-संस्कृति और प्रवाह साइटोमेट्री को संबद्ध करने वाली रणनीति का उपयोग किया। इस रणनीति को टीका लगाया नमूनों की संख्या में वृद्धि करने के लिए विकसित किया गया था, सेल का समर्थन करता है के रूप में इस्तेमाल protists विविधता लाने के लिए, और जल्दी से सेल समर्थन के lysis का पता लगाने के लिए. प्रारंभिक आण्विक जीव विज्ञान की पहचान से बचने और एक अज्ञात वायरल जनसंख्या का त्वरित पता लगाने से बचने के लिए एक पूरक कदम जोड़कर इस प्रणाली को अद्यतन किया गया था जैसा कि Pacmanvirus29के मामले में . मिमिवायरस और सेड्राटवायरस A1130के मिश्रण को अलग करने के लिए कोशिका छँटाई के लिए युग्मन प्रवाह साइटोमेट्री की अनुमति है। हालांकि, हम बाद में जुदाई और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा इन वायरल subpopulations का पता लगाने की सीमाओं का सामना करना पड़ा. अनुक्रमण के बाद, जब हम Faustovirus ST125 और Faustovirus LCD7 (अप्रकाशित डेटा) के जीनोम इकट्ठा, हम आश्चर्यजनक रूप से सार्वजनिक जीनोम डेटाबेस में पहचान नहीं दो उपन्यास वायरस के दो पूरक जीनोम प्रत्येक विधानसभा में पाया. हालांकि, न तो प्रवाह साइटोमेट्री और न ही संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी (टीईएम) से पता चला कि अमीबा दो अलग-अलग वायरस, Clandestinovirus ST1 और Usurpativirus LCD7 से संक्रमित थे। हमने विशिष्ट PCR सिस्टम को उनके जीनोम के आधार पर क्रमशः Faustovirus, Usurpativirus, और Clandestinovirus मार्कर को बढ़ाना बनाया है; हमारा उद्देश्य पीसीआर आधारित सिस्टम है कि अलग किया जा रहा वायरस की शुद्धता के सत्यापन सक्षम करने के लिए किया गया था। हालांकि, अंत बिंदु कमजोर पड़ने और प्रवाह साइटोमेट्री उन्हें अलग करने में विफल रहा। इस एकल वायरल आबादी के अलगाव मुश्किल था क्योंकि न तो morphiology और न ही Clandestinovirus और Usurpativirus आबादी के प्रतिकृति तत्वों की विशेषता है. हम दो आबादी के ओवरलैपिंग के कारण प्रवाह cytometry द्वारा केवल एक वायरल आबादी का पता चला (प्रभावी जुदाई के बाद परीक्षण). हम उन्हें 96-वेल प्लेटों पर एक कण छँटाई का उपयोग कर अलग करने की कोशिश की, लेकिन हम किसी भी साइटोपैथिक प्रभाव का पालन नहीं किया, और हम पीसीआर प्रवर्धन द्वारा न तो Clandestinovirus और न ही Usurpativirus का पता चला. अंत में, यह केवल अंत बिंदु कमजोर पड़ने का संयोजन एकल अमीबा सूक्ष्म आकांक्षा है कि Faustoviruses से इन दो कम बहुतायत विशाल वायरस के जुदाई सक्षम द्वारा पीछा किया गया था. जुदाई की यह विधि इस आलेख का ऑब्जेक्ट है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल सेल माइक्रो-आकांक्षा हैंडलिंग और इसके अच्छे कार्य की अवधि ऑपरेटर-निर्भर है। प्रयोग के विभिन्न चरणों के लिए परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। कार्य केंद्र के micromanipulation घटकों का उपयोग सूक्ष्म आकांक्षा ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को उनकी सलाह और क्लेयर Andrani अंग्रेजी सुधार और संशोधनों में उसकी मदद के लिए दोनों जीन Pierre Baudoin और Olivier Mbarek धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम संदर्भ ANR-10-IAHU-03 (M]diterran-e संक्रमण के साथ “निवेश d’avenir (भविष्य के लिए निवेश)” कार्यक्रम के तहत राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी द्वारा प्रबंधित फ्रेंच राज्य से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और R$gion Provence Alpes द्वारा कोटे डी’अज़ूर और यूरोपीय वित्त पोषण FEDER PRIMI.
Materials
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 With Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/ flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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