JoVE Journal Medicine

Medicine

En fluorescens-basert analyse for karakterisering og kvantifisering av lipid dråpe dannelse i Human intestinal Organoids

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150

Jorik M. van Rijn^1,2,3, Marliek van Hoesel^1,2, Sabine Middendorp^1,2

¹Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, ²Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, ³Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

Denne protokollen beskriver en analyse for karakterisering av lipid dråpe (LD) formasjon i menneskets intestinal organoids upon stimulering med fettsyrer. Vi diskuterer hvordan denne analysen brukes til kvantifisering av LD-formasjonen, og hvordan den kan brukes til screening med høy gjennomstrømming for legemidler som påvirker LD-formasjonen.

Abstract

Fôr lipider er tatt opp som frie fettsyrer (FAs) av tarm epitel. Disse FAs er intracellulært omgjort til triglyserider (TG) molekyler, før de er pakket inn i chylomicrons for transport til lymfe eller inn cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring. Et avgjørende skritt for dannelsen av LDs er katalysator for diacylglycerol acyltransferases (DGAT) i det siste trinnet av TG-syntese. LDs er viktig å buffer giftige lipid arter og regulere cellulær metabolisme i ulike celletyper. Siden det menneskelige tarm epitel er regelmessig konfrontert med høye konsentrasjoner av lipider, er LD formasjon av stor betydning for å regulere homeostase. Her beskriver vi en enkel analyse for karakterisering og kvantifisering av LD-formasjonen (LDF) ved stimulering med de vanligste umettede fettsyrer, oljesyre syre, i Human intestinal organoids. LDF-analysen er basert på det LD-spesifikke fluorescerende fargestoffet LD540, som gjør det mulig for kvantifisering av LDs ved konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller flyt flowcytometri. LDF-analysen kan brukes til å karakterisere LD-formasjonen i humane tarm epitelceller, eller til å studere menneskelige (genetiske) lidelser som påvirker LD-metabolismen, for eksempel DGAT1-mangel. Videre kan denne analysen også brukes i en høy gjennomstrømming rørledning for å teste romanen terapeutiske forbindelser, som gjenoppretter defekter i LD formasjon i intestinal eller andre typer organoids.

Introduction

Lipider er en avgjørende del av menneskets kosthold og spiller en viktig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når svelget, er kosttilskudd lipider degradert til frie fettsyrer (FFAs) og monoglyserider (MGs) av bukspyttkjertelen lipaser. Disse underlag blir så tatt opp av enterocytes av tarm epitel, hvor de først re-forestret til diglyserider (DG) av monoglyceride acyltransferases (MGAT) enzymer og senere til triglyserider (TG) ved diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)¹. Til slutt, disse TGS er integrert i enten chylomicrons for eksport til lymfe systemet eller cytosolic lipid dråper (LDs) for intracellulære lagring²^,³. Selv om chylomicrons er nødvendig for å distribuere kosttilskudd lipider til andre organer, er viktigheten av intracellulære fett lagring i LDs ikke helt klart. Imidlertid har LDs vist seg å utføre en regulerende funksjon i tarmen, da de langsomt slipper lipider inn i sirkulasjonen opp til 16 timer etter et måltid⁴. Videre har LDs blitt vist å beskytte mot giftige fatty acid konsentrasjoner, slik som i musen adipocytter under lipolytic forhold⁵.

DGAT1-proteinet er plassert på endoplasmatiske retikulum (ER)-membranen og spiller en avgjørende rolle i LD-formasjonen i tarm epitel. Homozygote mutasjoner i DGAT1 føre til tidlig utbruddet alvorlig diaré og/eller oppkast, hypoalbuminemia, og/eller (dødelig) protein-å miste intoleranse med intestinal svikt på fett inntak, illustrerer viktigheten av DGAT1 i lipid homeostase av den menneskelige intestinal epitel⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Siden forekomsten av DGAT1-mangel hos mennesker er sjelden, har tilgang til primære pasient-avledede celler vært knappe. Videre har den langsiktige kulturen i tarm epitelceller lenge vært begrenset til tumor-avledet cellelinjer som representerer normal fysiologi bare til en begrenset forlenge. Derfor har DGAT1-mediert ld-formasjon hovedsakelig blitt studert i fibroblaster eller animalsk avledede cellelinjer⁷^,¹⁰^,¹¹^,¹². Slik, det ble nylig vist at DGAT1-mangelfull pasient-avledet fibroblaster akkumuleres mindre LDs sammenlignet med sunne kontroll celler etter stimulering med oljesyre acid (OA)⁸.

Tidligere ble protokoller etablert for å kultur epitel stamceller fra alle Gastrointestinal organ i form av tredimensjonale (3D) organoids¹³. Disse intestinal organoids kan oppbevares i kultur i lang tid¹³, og tillate funksjonell studie av pasient-og intestinal location-spesifikke epitel egenskaper¹⁴. De er genetisk og phenotypically stabile og kan oppbevares, slik at lang tids ekspansjon og biobanking¹³.

Vi har nylig demonstrert at LD-formasjonen lett kan måles i humant intestinal organoids i en LD-formasjon (LDF)-analysen⁶. Når de utsettes for OA for 16 h, organoids generere LDs å beskytte cellene fra lipid-indusert toksisitet. Når OA konsentrasjonen er for høy, cellene dør av ordtak-mediert apoptose⁶. LDF-analysen ble tidligere vist å være i stor grad avhengig av DGAT1 som indikert av organoids avledet fra DGAT1-mutant pasienter og ved bruk av DGAT1-spesifikke hemmere⁶.

For LDF analysen beskrevet i detalj her, 3D organoids er kultivert fra intestinal biopsier og er passert ukentlig ved avbrudd i enkeltceller som lett danner nye organoids. For å kjøre LDF analysen, er ~ 7 500 organoid-avledet enkeltceller belagt i hver brønn av en 24-brønn plate. Organoids dannes over flere dager, inkubert over natten med 1 mM OA og beiset med LD540, en fluorescerende celle gjennomtrengelig LD-spesifikk fargestoff som forenkler bildebehandling. LD-formasjonen kvantifisert deretter av konfokalmikroskopi mikroskopi, fluorescerende plate leser eller strømnings flowcytometri.

Ved å skalere denne LD-formasjonen til et 96-format, kan analysen også brukes til analyse av LD-formasjonen med høy gjennomstrømming til skjermen for nye legemidler som påvirker LD-formasjonen i menneskelige tarm organoid kulturer, eller for å studere (menneskelige genetiske) lidelser som påvirker LD metabolisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All eksperimentering med menneskelig vev beskrevet her ble godkjent av etisk komité ved University Medical Center Utrecht (UMCU). Informert samtykke for vev innsamling, generering, lagring, og bruk av organoids ble innhentet fra pasienter ved Wilhelmina Children ' s Hospital (WKZ)-UMCU.

1. utarbeidelse av kultur Media

Merk: Denne protokollen bør utføres i et biosafety kabinett. Organoids skal håndteres i henhold til standard cellekultur retningslinjer.

Forbered basal kultur medium.
Merk: kultur medium uten vekstfaktorer omtales som basal medium (BM).
1. Tilsett 5 mL HEPES (1 M), 5 mL av L-glutamin (100 g) og 5 mL penicillin-Streptomycin (5 000 U/mL) til 500 mL av avansert Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium med ham ' s næringsstoff blanding F-12 for å forberede BM medium.
2. Oppbevar det klargjorte BM-mediet ved 4 ° c og bruk i maksimalt 2 måneder.
Forbered R-spondin og noggin conditioned medium (CM) i henhold til produsentens protokoll.
1. En kort stund, vokser opp cellene til ønsket mengde i hyperflasks med 5 x 10⁷ celler i 555 ml medium uten selektiv antibiotika per kolbe.
2. Dyrke cellene i 4 dager til confluent.
3. Bytt medium med BM og kultur for 8 ekstra dager.
4. Etter 8 dager med kultur ved 37 ° c, samle kultur medium og sentrifuger for 5 min på 450 x g til pellets eventuelle gjenværende celler.
5. Filteret sterilisere supernatanten og lagrer alikvoter på R-spondin eller noggin CM ved-20 ° c i maksimalt 6 måneder.
Forbered Wnt3A-CM i henhold til BOJ et al.¹⁵.
1. Kort, vokse opp cellene til ønsket mengde i 145 mm retter med 2 x 10⁶ celler i 20 ml medium uten selektiv antibiotika per tallerken. Pakk hver tallerken med plastfolie for å unngå fordamping av kulturen medium.
2. Etter 8 dager med kultur ved 37 ° c, samle kultur medium og sentrifuger for 5 min på 450 x g til pellets eventuelle gjenværende celler.
3. Filteret sterilisere supernatanten og oppbevarer alikvoter på Wnt3A-CM ved 4 ° c i maksimalt 2 måneder.
Forbered organoid ekspansjons medium.
Merk: Human liten intestinal organoid ekspansjon medium (se oppskriften i supplerende tabell 1) er referert til som hSI-EM. Følgende trinn vil produsere et endelig volum på 1 L hSI-EM, og kan skaleres opp eller ned etter behov.
1. Løs opp 1,46 g nikotinamid i 12 mL cellekultur karakter fosfat-bufret saltvann (PBS) for å skape en endelig fortynning av 1 M.
2. Løs opp 245 mg n-acetyl cystein i 3 mL cellekultur grade PBS for å skape en endelig fortynning av 500 mM.
  Merk: For å akselerere dannelsen av en løsning, kan nikotinamid og n-acetyl cystein bli inkubert i et vannbad ved 37 ° c. Begge løsninger kan tilberedes i batch, aliquoted og oppbevares ved-20 ° c for fremtidig bruk.
3. Filteret sterilisere begge løsningene gjennom et 0,22 μm-filter til et sterilt 15 mL rør.
4. Tilsett 167 mL BM til en steril 500 mL kultur medium kolbe. Tilsett 200 mL R-Spondin-CM, 100 mL noggin-CM og 100 μL av rekombinant mEGF (500 μg/mL) til en endelig konsentrasjon på 50 ng/mL.
5. Tilsett 10 mL av den sterilisert nikotinamid oppløsningen og 2,5 mL av den sterilisert n-acetyl cystein oppløsningen. Tilsett 20 mL B27 supplement (50x).
  Merk: På dette stadiet, er mediet referert til som hSI-EM uten WAS (Wnt3A-CM, A83-01, og SB202190), og kan aliquoted og lagres ved-20 ° c. Hvis mediet er aliquoted i mindre volumer, justerer du konsentrasjonen av de følgende trinnene i henhold til dette.
6. Til 500 av hSI-EM uten WAS, tilsett 10 mL Wnt3A CM av de siste nylagde batch og 10 mL Wnt3A CM av den nest siste batch for å minimere variasjon endringer i Wnt3A-CM forhold.
7. Legg A83-01 til en endelig konsentrasjon på 500 nM, og SB202190 til en endelig konsentrasjon på 10 μM.
8. Oppbevar de forberedte hSI-EM (med WAS) ved 4 ° c og bruk i maksimalt 2 uker.
  Merk: Legg ytterligere Y-27632 til en endelig konsentrasjon på 10 μM (referert til som hSI-EM + Y) når Krypter eller enkeltceller er kultivert eller organoids startes fra kryonisk bevaring.
Klargjør fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) buffer.
1. Tilsett 10 mL av fosterets kalv serum (FCS) til 40 mL PBS uten ca^{2 +}/mg^{2 +} for en endelig konsentrasjon på 10% FCS.
  Merk: Den FCS hindrer celler fra å følge utstyr.

2. kultur prosedyrer for Human små intestinal Organoids

Merk: Denne protokollen bør utføres i et biosafety kabinett. Organoids skal håndteres i henhold til standard cellekultur retningslinjer. Ved håndtering av organoids eller organoid celler, bør cellene holdes på isen når det er mulig. Cellene vil forbli levedyktig for et par timer etter høsting når dette er sikret. Organoids bør være kultivert i en standard cellekultur inkubator på 37 ° c med 5% CO₂. Disse vilkårene gjelder for alle inkubasjons trinn med organoids innebygd i kjelleren membran matrise (BMM; dvs. Matrigel) gjennom denne protokollen. Forfatterne har brukt tolvfingertarmen-avledet organoids for disse analysene.

Passaging organoids
Merk: Hver organoid kultur har sin egen dobling tid. Normalt kan små tarm organoids være passert 1:3 − 1:5 hver 7 − 10 dager. Ved passert som enkeltceller kan passaging effektivitet være opptil 1:20, avhengig av celle tetthet. For etablering og vedlikehold, er organoids kultivert i 24-brønn plater; for LDF-analysen, i enten 24-eller 96-brønn plater.
1. Forberedelse
  1. Pre-Warm utpakket 24-brønn vev kultur plater i en inkubator på 37 ° c, 5% CO₂ minst over natten og helst 5 dager i forveien.
    Merk: Pre-oppvarming vev kultur platene i cellen kultur inkubator sikrer riktig dannelse og feste av organoid-inneholdende dråper av BMM.
  2. For å redusere antall fryse-tine-sykluser, klargjør du 1 mL alikvoter BMM og oppbevar ved-20 ° c. Tin et hetteglass med BMM på is minst 30 min før du starter organoid passaging prosedyren.
  3. Hold en 50 mL tube BM på isen som vaske medium.
  4. Forbered hSI-EM som beskrevet i Seksjon 1,4, og Forbered en passende mengde hSI-EM + Y, for eksempel 15 mL for en full 24-brønn plate.
2. Samle organoids.
  1. Nøye aspirer kulturen medium uten å forstyrre dråper av BMM.
  2. Tilsett 500 μL av kaldt BM til første brønn av organoids, og forstyrre BMM dråper med organoids ved pipettering forsiktig opp og ned med en P1000 Pipet.
  3. Gjenta denne prosedyren med samme medium i neste brønn som nødvendig, men ikke høste mer enn 2 brønner per 500 μL av BM.
  4. Samle organoids i et lav bindings 1,5 mL mikrosentrifugen rør og snurr ned i en mini tabletop sentrifuge for 15 − 20 s (maks. 2 000 x g). Aspirer supernatanten helt og fjerne den siste bit av medium med en P200 Pipet.
    Merk: Når organoids kulturer ser rent under et mikroskop og ikke inneholder noen døde celler eller annet rusk, den BMM dråper kan høstes direkte i Trypsin stedet for BM i trinn 2.1.2.2. Etter trinn 2.1.2.3, gå direkte til inkubasjons i trinn 2.1.3.1.
3. Distansere organoids i enkeltceller.
  1. Tilsett 400 μL av Trypsin til spunnet ned-organoids. Ruge organoids ved 37 ° c i 5 min i et vannbad.
  2. Forstyrre de resterende aggregater av celler ved pipettering opp og ned forsiktig med en P200 Pipet. Igjen, ruge organoids ved 37 ° c i 5 min i et vannbad.
  3. Kontroller fremdriften til celle dissosiasjon under et mikroskop med 4X forstørrelse. Gjenta manuelle avbrudd og inkubasjons når store klumper av celler gjenstår.
  4. Når bare enkeltceller gjenstår, tilsett 1 mL BM og snurre cellene i en mini tabletop sentrifuge for 15 − 20 s.
  5. Aspirer supernatanten helt. Resuspend enkeltcellene i 200-μL av fersk hSI-EM med en P200 Pipet. Legg til ytterligere 800 μL av hSI-EM.
  6. Telle antall celler i suspensjon.
    Merk: I forfatternes laboratorium gir manuell telling av dissosiert organoid celler mer pålitelige resultater enn en automatisert celle teller. Når en automatisert celle teller brukes, bør celle tettheten for nedstrøms applikasjoner testes internt og justeres Hvis for lite eller for mange organoids vokser ut.
4. Seed organoids for vedlikehold eller lipid dråpe formasjon analysen.
  1. Beregn volumet av celler som er nødvendig for den endelige celle tettheten.
    Merk: Omtrent 250 celler/μL er en hensiktsmessig tetthet. I en 24-brønn plate, er 30 μL sådd i hver brønn, mens 5 μL er sådd i hver brønn av en 96-brønn plate.
  2. Ta ut riktig volum av fjæring og Juster tettheten til 750 celler/μL (eller spinn ned og resuspend når tettheten er for lav).
  3. Legg BMM til celle suspensjonen i et forhold på 2:1. Den endelige celle tettheten i denne blandingen er 250 celler/μL. Bland forsiktig suspensjonen ved pipettering, forsiktig unngå eventuelle bobler.
  4. I en forvarmet vevs kultur plate, seedet ut 3 10 μL dråper per brønn i en 24-brønn plate eller en enkelt 5 μL dråpe per brønn i en 96-brønn plate.
  5. Plasser platen i en inkubator ved 37 ° c, 5% CO₂ for 10 − 15 min for å befeste BMM-dråpene. I mellomtiden, pre-varme en passende mengde hSI-EM + Y i et vannbad ved 37 ° c.
  6. Legg forsiktig til 500 μL av forvarmet hSI-EM + Y til hver brønn av en 24-brønn plate eller 100 μL til hver brønn av en 96-brønn plate. Ruge cellene i en inkubator ved 37 ° c, 5% CO₂ og etter 2 − 3 dager endre medium til HSI-EM (uten Y) og oppdatere 2 − 3 ganger i uken.
    Merk: Etter 7 − 10 dager bør en vedlikeholds kultur for organoids passert igjen.

3. lipid dråpe formasjon analysen

Fremstilling av oljesyre syre bøy
Merk: siden oljesyre syre (OA) er hydrofobe og ikke løselig i vann, er det bøyd til storfe serum albumin (BSA). BSA kan binde flere fettsyrer molekyler og er i dette tilfellet brukes i en 1:8 ratio å gjøre oljesyre syre tilgjengelig for intestinal celler. Frie fettsyrer og BSA kan både bindes til plast utstyr. For å sikre en riktig sluttkonsentrasjon, bruk glass ampuller og glass pipets når det er mulig.
1. Veie 0,2 g flytende oljesyre syre ved romtemperatur. Tilsett 1,5 mL sterilt PBS av kultur kvalitet, og varm opp blandingen til 70 ° c for 1 t. Vortex midlertidig.
2. Veie 5,89 g av fatty acid-fri BSA og oppløses i 33,9 mL av PBS. Varm opp blandingen i et vannbad ved 37 ° c til BSA er helt oppløst.
3. Vortex OA blandingen igjen for å lage en emulsjon av fine dråper og umiddelbart legge det til BSA løsningen ved hjelp av et glass Pipet. Hold den endelige løsningen nær 37 ° c etter at du har lagt til OA. Den siste blandingen består av 20 mM OA i 2,5 mM BSA.
4. Behold blandingen ved 37 ° c i 30 minutter til det gjenstår en klar gulaktig oppløsning.
5. OA-BSA-bøy kan aliquoted og fryses ved-20 ° c i minst 6 måneder. Ved tine en alikvot, ruge det ved 37 ° c til skydekke oppløses og blandingen er klar igjen.
  Merk: På grunn av det høye proteinet og lipid innholdet i den endelige løsningen, kan ikke blandingen filtreres sterilisert eller autoklaveres. Når komponentene ble håndtert med forsiktighet, i en laminær Flow hette når det er mulig og ved hjelp av sterile PBS, gjorde forfatterne ikke oppleve mikrobielle infeksjoner.
LDF konfokalmikroskopi analysen
1. Eksempel på tilberedning
  1. Passage organoids som beskrevet i avsnitt 2,1. Seed ut de organoid enkeltcellene i en svart, klar bunn 96-brønn plate.
  2. På dag 6 av kulturen på hSI-EM, erstatte kultur medium med hSI-EM inneholder 1 mM OA-BSA bøye.
  3. Ruge cellene for 16 − 17 t (over natten) ved 37 ° c i nærvær eller fravær av 0,1 μM DGAT1-hemmer. Inkluder en kjøretøy kontroll på 2,5 mM BSA.
  4. Etter 16 − 17 timer aspirer mediet uten å forstyrre BMM-dråpene. Fixate organoids ved å tilsette 100 μL av 4% nøytral bufret formaldehyd til brønnene i 30 min ved romtemperatur.
    Merk: Formaldehyd vil delvis oppløse BMM, mens organoids synker til bunnen og holder seg til bunnen av platen.
  5. Fjern formaldehyd forsiktig, og vask brønnene nøye med 150 μL av PBS per brønn.
  6. Stain cellene for LDs med 0,025 mg/mL LD540 og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i PBS for 15 min ved romtemperatur i mørket.
  7. Vask brønnene nøye med PBS.
    Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her når det er nødvendig. Oppbevar prøvene dekket i PBS i mørket ved 4 ° c. Den LD540 farging vil holde seg stabilt i opptil en uke. Denne analysen kan også utføres med levende celler, for å overvåke LD formasjon over en tidsperiode. For dette må fiksering utelates fra protokollen, og DAPI skal erstattes med Hoechst farging. LD540 kan flekken LDs i levende celler i samme konsentrasjon som beskrevet.
2. Konfokalmikroskopi avbildning
  Merk: Bildebehandling kan utføres på forberedt organoid prøver i den svarte, klare bunnen 96-brønn plate.
  1. For Oversiktsbilder av hele organoids, bruk et 40x-objektiv som passer til konfokalmikroskopi fluorescerende bilde.
  2. Still inn mikroskopet for å avbilde DAPI-kanalen ved 405 NM eksitasjon og ca. 410 − 535 NM utslipps bølgelengde. For LD540 fargestoff velge en eksitasjon laser ved 540 NM (543 NM er optimal) og sette utslipps filtrene til 545 − 700 NM.
    Merk: I denne protokollen, en laser-skanning konfokalmikroskopi system med en hvit lyset laser, akustiske-optisk stråle splitter (AOBS), 10x/20x mål, og Spectral oppdagelsen system var anvendt. Dette gjør det mulig for eksakt tuning til de spesifikke bølgelengder. Hvis et tilsvarende system ikke er tilgjengelig, velger du laser linjer og/Long-pass filtre i nærheten av spesifikasjonene ovenfor. For organoid avbildning er en oppløsning på 512 x 512 eller 1024 x 1024 tilstrekkelig for nedstrøms bildeanalyse.
  3. Sett pinhole størrelse til 1 luftig enhet (AU) for tilstrekkelig z-akse oppløsning.
  4. Hvis du vil avbilde halvparten av en sfærisk organoid, setter du en z-stabel til ca. 85 μm.
3. Image analyse
  Merk: For bilde^{analyse ble Fiji} /ImageJ¹⁶brukt til å generere maksimalt anslag. Analysen kan utføres med alle bildeanalyse programvarepakke som gir maksimal projeksjon, manuell terskelverdi, og partikkel analyse.
  1. Bruke Fiji/ImageJ, transformere z-stakken for hver organoid til en maksimal projeksjon: Image | Stabler | Z-Project.
  2. Angi terskelen for maksimal projeksjon til et nivå der det ikke er noe LD540-signal synlig i BSA kjøretøyets kontroll utvalg: bilde | Juster | Terskelen. Bruk disse innstillingene til å terskel hvert bilde.
  3. Mål det totale arealet av fluorescens for hver maksimal projeksjon ved hjelp av funksjonen analysere | Analysere partikler.
    Merk: Selv om analysen oppløsningen er bedre å bruke en konfokalmikroskopi mikroskop, denne analysen kan også analyseres ved hjelp av en fluorescerende plate leser med lignende filtre. For å normalisere for det organoid antallet per brønn, bør LD540-signalet deles med DAPI-signalet. Til slutt bør signalet fra BSA-kjøretøyets kontroll trekkes for å normalisere målingene. Denne tilnærmingen gjør at analysen skal skaleres mot en 96-brønn plateformat.
LDF Flow analytiske analysen
1. Eksempel på tilberedning
  1. Passage organoids som beskrevet i avsnitt 2,1. Seed ut organoid-avledet enkeltceller i en 24-brønn vev kultur plate. To brønner per betingelse er tilstrekkelig for strømnings flowcytometri.
  2. På dag 10 av kulturen på hSI-EM, erstatte kultur medium med hSI-EM inneholder 1 mM OA-BSA bøye.
    Merk: I motsetning til konfokalmikroskopi analyse, ble 10 dager med vekst i EM valgt for flyten flowcytometri analysen i stedet for 6 dager. De ekstra 4 dager med ekspansjon vil resultere i optisk overlappende organoids som ville komplisere den mikroskopi analysen. Men jo større antall celler forenkler flyt flowcytometri analyse.
  3. Ruge cellene for 16 − 17 t (over natten) ved 37 ° c i nærvær eller fravær av 0,1 μM DGAT1-hemmer. Inkluder en kjøretøy kontroll på 2,5 mM BSA.
  4. Etter 16 − 17 timer, samle organoids som beskrevet i Seksjon 2.1.2.
  5. Distansere organoids i enkeltceller som beskrevet i avsnitt 2.1.3.
    Merk: Selv om det ikke er strengt nødvendig, anbefales det å sjekke celle tellingen i hver prøve. Totalt antall 10 000 celler per utvalg er det absolutte minimumskravet for tilstrekkelig oppløsning. For optimale resultater, bruk ca. 50000 − 100000 celler.
  6. Snurr ned cellene i en mini tabletop sentrifuge for 15 − 20 s.
  7. Beis hver prøve med 500 μL av 0,025 mg/mL LD540 og 1 μg/mL Hoechst i PBS i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.
  8. Snurr ned cellene i en mini tabletop sentrifuge for 15 − 20 s og vask 3x med PBS.
  9. Fixate cellene ved blanding dem i 500 μL av 4% nøytral bufret formaldehyd i 15 min ved romtemperatur.
  10. Snurr ned cellene og vask 3x med FACS buffer.
  11. Pre-skyll FACS rør med FACS buffer for å hindre at cellene stikker til røret veggen.
  12. Resuspend cellene i 200-μL av FACS-buffer og Overfør celle fjæringen til de pre-skylt FACS-rørene.
2. Flow analytiske analyse
  1. Angi gating parametere for å utelukke døde celler og klumper av celler (se representative resultater delen).
  2. I den siste gated befolkningen, måle minst 10 000 celler for pålitelige resultater.
    Merk: Fra denne populasjonen gir gjennomsnittlig fluorescerende intensitet (MFI) av LD540 og gjennomsnittlig SSC-A-signal sammen et mål på det totale volumet av LD-dannelse per celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For riktig analyse av LD-formasjonen bør ikke organoids være for tett før stimulering med OA og påfølgende farging. Dette er spesielt av betydning for konfokalmikroskopi og plate leser avlesning, siden overlappende organoids kan forstyrre fluorescens. Et eksempel på riktig organoid seeding tetthet (figur 1A) og en kultur med overlappende organoids vises (figur 1B). For å minimere variasjon i prøve stimulering med OA, bør organoid størrelse og seeding tetthet være sammenlignbare mellom prøver i ett eksperiment. Dette er best kontrollert av seeding ut et likt antall enkeltceller. Noen justeringer kan imidlertid være nødvendig hvis visse organoid linjer konsekvent viser en høyere rekonstituering effektivitet og dermed en gjennomgående høyere organoid teller.

Etter stimulering med 1 mM OA over natten, kan LD-formasjonen vises med et invertert brightfield mikroskop. Den akkumulering av LDs sprer overført lys, og derfor organoids vises mørkere, mens ikke-stimulert organoids har et gjennomskinnelig utseende (figur 1C). Et eksempel på LD-formasjon sett under et brightfield mikroskop er vist i figur 1D. Dette fenomenet kan brukes til å vurdere eksperimentelle forhold før fluorescerende analysen avlesning. Når positiv kontroll prøven ikke er visuelt mørkere enn den negative kontrollen prøven, eller når omfattende celle død er åpenbar, bør eksperimentet kastes. Ettersom FFAs er giftig for celler i høyere konsentrasjoner, og den dødelige konsentrasjonen er forskjellig mellom arter av FFAs, bør den optimale subletale konsentrasjonen som induserer LD formasjon være titrert for hvert program.

Når OA-stimulert organoids er faste og beiset henhold til protokollen, kan LDF bli visualisere ved hjelp av en konfokalmikroskopi mikroskop. Som organoids er 3D-strukturer, et vanlig epifluorescent mikroskop er ikke egnet på grunn av ut-av-fokus bakgrunns signal. Derfor brukte vi en (maksimal projeksjon av a) konfokalmikroskopi z-stakken til å karakterisere LDF i organoids. Figur 2a viser et representativt resultat av ld farging i sunne kontroll organoids som ble behandlet med eller uten en DGAT1-hemmer. Selv om kvantifisering av disse bildene er arbeidskrevende, tjener konfokalmikroskopi analyse hovedsakelig som et visualiseringsverktøy for å se etter unormal LD-formasjon. Kvantifisering av konfokalmikroskopi mikroskopi prøvene kan også utføres ved hjelp av en fluorescerende plate leser (figur 2B), normalisert til fluorescerende Hoechst signal. Platen leseren analysen indikerer en betydelig reduksjon i LD540 signal i organoids celler behandlet med DGAT1 inhibitor (D1i) sammenlignet med ubehandlet organoids.

Kvantifisering av LD-formasjonen i enkeltceller kan oppnås ved hjelp av strømnings flowcytometer. Det gating strategi anvendt for dissosiert Human intestinal organoids er vist inne skikkelsen 3en. Det første trinnet i gating i FSC-A/SSC-et plott er et første valg av "live" (når fast), enkeltceller. For ytterligere å ekskludere doublets, trillinger, eller større celle klumper, inkluderte vi ytterligere to gating trinn på FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H. Til slutt sikrer gating på FSC-A/Hoechst utelukkelse av alle celler som var døde eller døende før fiksering. Figur 3B, C viser histogrammer av både SSC-A og LD540 signal av den endelige Live cellen befolkning. LDF vil resultere i en økning i SSC-A på grunn av dannelsen av intracellulære lipid dråper. I tillegg LD540 flekker for lipider som er lagret i LDs og dette signalet vil også øke på LDF induksjon. Som sådan måles LD formasjon som et skifte i MFI av både SSC-A og LD540 (Figur 3D, E). Den MFI kan tegnes og brukes til å utføre statistisk analyse.

Figur 1: Organoid kulturer som brightfield mikroskopi. (A, B) For konfokalmikroskopi og fluorescerende plate leser metoder, er det viktig at organoids ikke er sådd i for høy tetthet i BMM dråpe. (A) Organoids er sådd i en passende tetthet på 250 celler/μL. (B) Organoids ble sådd i en for høy tetthet, forårsaker overlapping av Organoids og celle død. (C, D) Etter over natten stimulering med OA kan LD-formasjonen vurderes visuelt. (C) Organoids ble inkubert over natten med 12% BSA kjøretøy kontroll. (D) Organoids ble inkubert over natten med 1 mm OA BØYD til BSA, noe som resulterte i et mørkt utseende. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: representative resultater av LDF karakterisering ved hjelp av konfokalmikroskopi bildebehandling og en fluorescerende plate leser. Sunn kontroll-avledet-organoids ble stimulert over natten med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) maksimal projeksjon av 85 μm konfokalmikroskopi stabler BEISET for DAPI (cyan) og LD540 (gul). Denne subfigure er tilpasset fra Van Rijn et al.⁶. (B) relative FLUORESCENS intensitet LD540 normalisert til kjernefysiske DAPI signalet målt ved hjelp av en fluorescerende plate leser. Mean ± SD er plottet for to biologiske replikerer. Statistisk betydning ble bestemt ved hjelp av en enveis ANOVA uten gjentatte tiltak med Tukey ' s post-hoc. *, P < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: representative resultater fra LDF kvantifisering ved hjelp av flyt flowcytometri. Sunn kontroll-avledet-organoids ble stimulert over natten med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) gating strategi for å velge for organoid-avledede enkeltceller. Fra venstre til høyre, først utelukke rusk av gating for FSC-A/SSC-A. Deretter gate på FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H å utelukke doublets, trillinger, eller større klumper av celler. Til slutt, gate for FSC-A/Hoechst å velge for levende celler. Både SSC-A og LD540-kanalene brukes til å kvantifisere LD-formasjonen. Histogrammer av disse parametrene viser et skifte i gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) av (B) SSC-a og (C) LD540 upon stimulering med OA. (D, E) MFI per prøve kan tegnes inn i en graf og brukes til å utføre statistisk analyse. Mean ± SD er plottet for tre biologiske replikerer. Statistisk betydning ble bestemt ved hjelp av en enveis ANOVA uten gjentatte tiltak med Tukey ' s post-hoc. *, P < 0,05; * *, P < 0,01; , P < 0,001. Dette tallet er tilpasset fra Van Rijn et al.⁶. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Kjemiske	Løsemiddel	Stock konsentrasjon	Endelig konsentrasjon
Wnt3a CM	-	100 prosent	50 prosent
R-spondin-1 CM	-	100 prosent	20
Noggin CM	-	100 prosent	10
A83-01 (TGFβ-inh)	Dmso	50 mM	500 nM
B27	-	50x	1x
mEGF	PBS/0.1% BSA	500 μg/mL	50 ng/mL
N-acetyl	Vann	500 mM	1,25 mM
Nikotinamid	Pbs	1 M fra	10 mM av
Primocin (bruk til MCB er i fryseren)	-	50 mg/mL	100 μg/mL
SB202190 (P38 inh)	Dmso	30 mM	10 μM

Supplerende tabell 1: oppskrift på organoid ekspansjons medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en protokoll for å bestemme LD formasjon i menneskets intestinal organoids upon inkubasjons med oljesyre syre. Denne metoden er basert på LD-spesifikke fluorescerende fargestoff LD540¹⁸, som gjør det mulig for karakterisering og kvantifisering av det totale volumet av lipid dråper i en organoid kultur. Prosedyrene for å etablere og vedlikeholde menneskelige intestinal organoid kulturer har blitt publisert før¹³, og en visuell guide av denne protokollen er tilgjengelig i tillegg¹⁵.

De avgjørende trinnene i denne protokollen er kulturen i menneskets intestinal organoids, og riktig Bøyning av OA til BSA. Kulturen i organoids krever en riktig formulering av kulturen medium, som vedlikehold av en stilk cellen befolkning er svært avhengig av funksjonell Wnt3A-CM. Når Wnt3A-CM er laget i huset, anbefaler vi en svært standardisert arbeidsflyt og den månedlige produksjonen av betinget medium på grunn av utløpstiden på ca 2 måneder. Videre 1:1 blanding av påfølgende Wnt3A-CM batcher resulterer i en mer konstant langsiktig kultur, som det sikrer at en litt sub-optimale batch vil ikke ha en stor innvirkning på organoid vekst.

I tillegg består vår BM av avanserte DMEM/F12 medium, som inneholder lipid-rik BSA. Siden vår kontroll av kjøretøyet (12% BSA/BM) ikke induserer LD-formasjonen i organoids, konkluderer vi med at mengden eller typen FFA i BM ikke er tilstrekkelig til å påvirke LDF-analysen.

Bøyning av OA til BSA er en delikat prosess som kan kreve noe optimalisering. Vi opplevde at protokollen som beskrives her, er mest optimal når alle temperaturendringer følges omhyggelig og når de utføres ved hjelp av glass utstyr.

I tidligere forskning, ld formasjon analyser har blitt brukt til å karakterisere ld størrelse og tall med høy forstørrelse⁸^,¹². Disse analysene var stort sett utført ved hjelp av bor-dipyrromethene (BODIPY) 493/503, som gir en utmerket farging for LDs med høy signal-til-støy-forhold. Imidlertid er utslipp spekteret av BODIPY ganske bred, og i stor grad overlapper med fluorescerende spekteret av grønne fluorescerende protein (GFP)-avledet fargestoffer. Selv om vi forventer at dagens anvendelse av LDF analysen ville fungere med BODIPY også, valg for LD540 gir et bredere spekter av flerfarget bilder, inkludert co-farging med GFP etiketter¹⁸. Vi har også utført denne analysen ved hjelp av lipid flekken Nilen rød (data ikke vist). Men siden Nilen rød tendens til å flekk ikke bare LDs, men også lipid bilayers, fant vi at jo høyere bakgrunns signal av Nilen rødt senker kapasiteten på analysen vår for å skille små forskjeller i LD formasjon. Av disse grunner foretrekker vi å bruke LD540 i en organoid LDF-analyse.

Sammenlignet med tidligere studier med høy forstørrelse LDF analyser, gir analysen vi beskriver her for høy gjennomstrømming kvantifisering av totalt LD volum i en stor befolkning av celler. Derfor, spesielt den fluorescerende plate leser kvantifisering, og potensielt flyten analytiske analyse, kan skaleres for å teste effekten av narkotika på LD formasjon. Som vi har vist at LD-formasjonen i stor grad er DGAT1 avhengig, DGAT1-mangelfull pasient-avledet eller D1i-behandlet organoids representerer en klar mulighet for anvendelsen av en slik screening. Spesielt for slike sjeldne forekommende sykdommer, LDF analysen kombinert med pasient-avledet organoids kunne gi en plattform for pasient-spesifikk screening for nye terapeutiske stoffer.

En konsekvens av en tilnærming med høy gjennomstrømming er imidlertid at evnen til å karakterisere den enkelte LDs går tapt. Selv om høy forstørrelses elektron mikroskopisk eller fluorescerende visualisering av LDs kan brukes til å studere dynamikken i ld-størrelse og nummer¹²^,¹⁹, skiller ikke tilnærmingen med høy gjennomstrømming mellom flere små eller færre store LDs og kan derfor ikke brukes til å kvantifisere forskjeller i LD metabolisme der til totalt volum av LDs forblir konstant. Derfor, i programmer der antallet eller størrelsen på LDs er mistenkt for å være av interesse, bør dette rettes med en lavere gjennomstrømming, høyere forstørrelse teknikk. Videre organoids i dagens analysen får basolateral lipid stimulering mens kosten lipider er vanligvis tatt opp på apikale membranen. Noen forsiktighet er derfor nødvendig hvis resultatene skal oversettes til den fysiologiske situasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker B. Spee for sjenerøst gir LD540. Dette arbeidet ble støttet av en Nederland organisasjon for Scientific Research stipend (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-028
B27 supplement	Gibco	17504-044
Basement membrane matrix (matrigel)	BD Biosciences	356231
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988)	Tocris Bioscience	4837/10
Fatty acid free BSA	Sigma-Aldrich	A7030
Formaldehyde	Klinipath	4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x)	Gibco	15630-056
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Laser scanning confocal microscope	Leica	SP8X
LD540			kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-100G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma-Aldrich	S7067-25MG
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
PBS without Ca²⁺/Mg²⁺	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)	R&D systems	3710-001-01
TC-treated 24 well plates	Greiner-One	662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates	Corning Life Sciences	353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)	Tocris Bioscience	2939/10
Trypsin (TrypLE Express)	Life Technologies	12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)	Abcam	ab120129-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Cite this Article

van Rijn, J. M., van Hoesel, M.,… More

van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video

Medicine

En fluorescens-basert analyse for karakterisering og kvantifisering av lipid dråpe dannelse i Human intestinal Organoids

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

PLAYLIST

Diagnostic Procedure

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

PLAYLIST Diagnostic Procedure

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

PLAYLIST

Diagnostic Procedure