Summary
Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.
Abstract
Les lipides alimentaires sont pris comme acides gras libres (AF) par l'épithélium intestinal. Ces FUR sont intracellulairement convertis en molécules de triglycérides (TG), avant d'être emballés dans des chylomicrons pour le transport vers la lymphe ou en gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire. Une étape cruciale pour la formation des LDest l'activité catalytique des acyltransferases de diacylglycérol (DGAT) dans l'étape finale de la synthèse de TG. Les LD sont importants pour amortir les espèces lipidiques toxiques et réguler le métabolisme cellulaire dans différents types de cellules. Puisque l'épithélium intestinal humain est régulièrement confronté à des concentrations élevées de lipides, la formation de LD est d'une grande importance pour réguler l'homéostasie. Ici nous décrivons un test simple pour la caractérisation et la quantification de la formation de LD (LDF) sur la stimulation avec l'acide gras insaturé le plus commun, l'acide oliétique, dans les organoïdes intestinaux humains. L'analyse LDF est basée sur le colorant fluorescent LD540 spécifique à LD, qui permet la quantification des LD par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux. L'analyse de LDF peut être employée pour caractériser la formation de LD dans les cellules épithéliales intestinales humaines, ou pour étudier les désordres humains (génétiques) qui affectent le métabolisme de LD, tels que l'insuffisance de DGAT1. En outre, cet essai peut également être employé dans un pipeline à haut débit pour tester de nouveaux composés thérapeutiques, qui restaurent des défauts dans la formation de LD dans l'intestin ou d'autres types d'organoïdes.
Introduction
Les lipides sont un élément crucial de l'alimentation humaine et jouent un rôle important dans le stockage et le métabolisme de l'énergie systémique. Lorsqu'ils sont ingérés, les lipides alimentaires sont dégradés en acides gras libres (AFF) et en monoglycérides (GM) par des lipases pancréatiques. Ces substrats sont ensuite repris par les entéroocytes de l'épithélium intestinal, où ils sont d'abord réestérifiés aux diglycérorides (DG) par des enzymes d'acyltransferases monoglycérides (MGAT) et par la suite aux triglycérides (TG) par le diacylglycérol par le diacylglycérol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Enfin, ces TG sont intégrés soit dans les chylomicrons pour l'exportation vers le système lymphatique ou les gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire2,3. Bien que les chylomicrons soient nécessaires pour distribuer les lipides diététiques à d'autres organes, l'importance du stockage intracellulaire de graisse dans des LDs n'est pas complètement claire. Cependant, LDs ont été montrés pour effectuer une fonction de régulation dans l'intestin, car ils libèrent lentement des lipides dans la circulation jusqu'à 16 h après un repas4. En outre, lDs ont été montrés pour se protéger contre les concentrations toxiques d'acide gras, telles que dans les adipocytes de souris pendant des conditions lipolytiques5.
La protéine DGAT1 est située sur la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et joue un rôle crucial dans la formation de LD dans l'épithélium intestinal. Les mutations homozygous dans DGAT1 mènent à la diarrhée grave tôt-début et/ou au vomissement, à l'hypoalbuminemia, et/ou (fatal) entéropathie protéine-perdante avec l'échec intestinal sur la prise de graisse, illustrant l'importance de DGAT1 dans l'homéostasie de lipide de l'humain épithélium intestinal6,7,8,9,10. Puisque l'occurrence de DGAT1-deficiency chez l'homme est rare, l'accès aux cellules patient-dérivées primaires a été rare. En outre, la culture à long terme des cellules épithéliales intestinales a longtemps été limitée aux lignées cellulaires dérivées de tumeurs qui ne représentent la physiologie normale que dans une extension limitée. Par conséquent, la formation de LD DGAT1-négociée a été principalement étudiée dans les fibroblastes ou les lignées cellulaires d'origine animale7,10,11,12. En tant que tel, il a été récemment démontré que les fibroblastes d'origine patiente DGAT1 accumulent moins de LD que les cellules témoins saines après stimulation avec de l'acide oleique (OA)8.
Auparavant, des protocoles ont été établis pour la culture des cellules souches épithéliales de tout organe gastro-intestinal sous la forme d'organoïdes tridimensionnels (3D)13. Ces organoïdes intestinaux peuvent être maintenus en culture pendant une longue période de temps13, et permettent l'étude fonctionnelle des caractéristiques épithéliales spécifiques au patient et à l'intestin14. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, permettant l'expansion à long terme et la biobanque13.
Nous avons récemment démontré que la formation de LD peut être facilement mesurée dans les organoïdes intestinaux humains dans une formation de LD (LDF) analyse6. Lorsqu'ils sont exposés à l'arthrose pendant 16 h, les organoïdes génèrent des LD pour protéger les cellules contre la toxicité induite par les lipides. Lorsque les concentrations d'arthrose sont trop élevées, les cellules meurent par apoptose à médiation caspase6. L'assay de LDF a été précédemment montré pour être en grande partie dépendant de DGAT1 comme indiqué par des organoïdes dérivés des patients DGAT1-mutants et par l'utilisation des inhibiteurs DGAT1-spécifiques6.
Pour l'analyse LDF décrite en détail ici, les organoïdes 3D sont cultivés à partir de biopsies intestinales et sont passés chaque semaine par perturbation en cellules individuelles qui forment facilement de nouveaux organoïdes. Pour l'exécution de l'assidu, 7 500 cellules uniques d'origine organoïde sont plaquées dans chaque puits d'une plaque de 24 puits. Les organoïdes sont formés sur plusieurs jours, incubés pendant la nuit avec 1 mM d'arthrose et tachés de LD540, un colorant fluorescent perméable lD-spécifique qui facilite l'imagerie. La formation LD est ensuite quantifiée par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux.
En évoluant cette analyse de formation de LD à un format de 96 puits, l'analyse peut également être employée pour l'analyse à haut débit de la formation de LD pour dépister de nouveaux drogues qui affectent la formation de LD dans les cultures d'organoïdes intestinaux humains, ou pour étudier les désordres (génétiques humains) qui affectent Métabolisme LD.
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Protocol
Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits ci-dessous ont été approuvées par le comité d'éthique du Centre Médical Universitaire d'Utrecht (UMCU). Le consentement éclairé pour la collecte, la génération, le stockage, et l'utilisation des organoïdes a été obtenu des patients à l'hôpital pour enfants de Wilhelmina (WKZ)-UMCU.
1. Préparation des médias culturels
REMARQUE: Ce protocole doit être exécuté à l'intérieur d'une armoire de biosécurité. Les organoïdes doivent être manipulés selon les directives standard de culture cellulaire.
- Préparer le milieu de culture basale.
REMARQUE : Le milieu de culture sans facteurs de croissance est appelé milieu basal (BM).- Ajouter 5 ml de HEPES (1 M), 5 ml de L-glutamin (100x) et 5 ml de pénicilline-streptomycine (5 000 U/mL) à 500 ml de milieu Eagle modifié avancé de Dulbecco avec le mélange nutritif F-12 de Ham pour préparer le milieu BM.
- Conserver le support BM préparé à 4 oC et l'utiliser pendant un maximum de 2 mois.
- Préparer le milieu conditionné R-spondin et Noggin (CM) selon le protocole du fabricant.
- En bref, grandir les cellules à la quantité désirée en hyperflasks avec 5 x 107 cellules dans 555 ml milieu sans antibiotique sélectif par flacon.
- Cultivez les cellules pendant 4 jours jusqu'à ce que confluent.
- Remplacer le médium par bM et la culture pendant 8 jours supplémentaires.
- Après 8 jours de culture à 37 oC, recueillir le milieu de culture et la centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g pour granuler les cellules restantes.
- Filtrer stériliser le supernatant et stocker les aliquots du R-spondin ou du Noggin CM à -20 oC pendant un maximum de 6 mois.
- Préparer Wnt3A-CM selon Boj et al.15.
- En bref, faire pousser les cellules à la quantité désirée dans des plats de 145 mm avec 2 x 106 cellules dans 20 ml milieu sans antibiotique sélectif par plat. Envelopper chaque plat de papier d'aluminium en plastique pour éviter l'évaporation du milieu de culture.
- Après 8 jours de culture à 37 oC, recueillir le milieu de culture et la centrifugeuse pendant 5 min à 450 x g pour granuler les cellules restantes.
- Filtrer stériliser le supernatant et stocker les aliquots du Wnt3A-CM à 4 oC pendant un maximum de 2 mois.
- Préparer le milieu d'expansion organoïde.
REMARQUE : Le petit milieu d'expansion intestinal d'organoïde humain (voir la recette dans le tableau supplémentaire 1) est désigné sous le premier hSI-EM. Les étapes suivantes produiront un volume final de 1 L hSI-EM, et peuvent être mis à l'échelle vers le haut ou vers le bas au besoin.- Dissoudre 1,46 g de nicotinamide dans 12 ml de saline tamponnée de phosphate de qualité de culture cellulaire (PBS) pour créer une dilution finale de 1 M.
- Dissoudre 245 mg de cystéine n-acétyl en 3 ml de PBS de qualité de culture cellulaire pour créer une dilution finale de 500 mM.
REMARQUE: Pour accélérer la formation d'une solution, la cystéine de nicotinamide et de n-acétyl peut être incubée dans un bain d'eau à 37 oC. Les deux solutions peuvent être préparées en lot, aliquoted, et stockées à -20 oC pour une utilisation future. - Filtrer stériliser les deux solutions à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m dans un tube stérile de 15 ml.
- Ajouter 167 ml de BM à un flacon de culture stérile de 500 ml. Ajouter 200 ml de R-Spondin-CM, 100 ml de noggin-CM et 100 l de mEGF recombinant (500 g/mL) à une concentration finale de 50 ng/mL.
- Ajouter 10 ml de la solution de nicotinamide stérilisée et 2,5 ml de la solution stérilisée de cystéine n-acétyl. Ajouter 20 ml de supplément B27 (50x).
REMARQUE: À ce stade, le support est appelé hSI-EM sans WAS (Wnt3A-CM, A83-01, et SB202190), et peut être aliquoted et stocké à -20 oC. Si le milieu est aliquoted dans de plus petits volumes, ajustez les concentrations des étapes suivantes en conséquence. - À 500 ml de hSI-EM sans WAS, ajouter 10 ml de Wnt3A-CM du dernier lot fraîchement préparé et 10 ml de Wnt3A-CM de l'avant-dernier lot pour minimiser les changements de variabilité dans les conditions Wnt3A-CM.
- Ajouter l'A83-01 à une concentration finale de 500 nM, et le SB202190 à une concentration finale de 10 M.
- Conserver le hSI-EM préparé (avec WAS) à 4 oC et l'utiliser pendant un maximum de 2 semaines.
REMARQUE: Ajoutez du Y-27632 supplémentaire à une concentration finale de 10 M (appelée hSI-EM-Y) lorsque des cryptes ou des cellules individuelles sont cultivées ou que les organoïdes sont commencés à partir de la cryoconservation.
- Préparer le tampon de tri des cellules activées fluorescentes (FACS).
- Ajouter 10 ml de sérum fœtal de veau (FCS) à 40 ml de PBS sans Ca2 /Mg2 pour une concentration finale de 10 % de FCS.
REMARQUE: Le FCS empêche les cellules d'adhérer aux labwares.
- Ajouter 10 ml de sérum fœtal de veau (FCS) à 40 ml de PBS sans Ca2 /Mg2 pour une concentration finale de 10 % de FCS.
2. Procédures de culture pour les petits organoïdes intestinaux humains
REMARQUE: Ce protocole doit être exécuté à l'intérieur d'une armoire de biosécurité. Les organoïdes doivent être manipulés selon les directives standard de culture cellulaire. Lors de la manipulation des organoïdes ou des cellules d'origine organoïde, les cellules doivent être maintenues sur la glace chaque fois que possible. Les cellules resteront viables pendant quelques heures après la récolte lorsque cela sera assuré. Les organoïdes doivent être cultivés dans un incubateur de culture cellulaire standard à 37 oC avec 5 % de CO2. Ces conditions s'appliquent à toutes les étapes d'incubation avec des organoïdes intégrés dans la matrice membranaire du sous-sol (BMM; c.-à-d. Matrigel) tout au long de ce protocole. Les auteurs ont utilisé des organoïdes dérivés du duodénum pour ces essais.
- Les organoïdes de passage
note: Chaque culture organoïde a son propre temps de doublement. Normalement, les petits organoïdes intestinaux peuvent être adoptés 1:3-1:5 tous les 7-10 jours. Lorsqu'il est transmis en tant que cellules simples, l'efficacité de passage peut être jusqu'à 1:20, selon la densité cellulaire. Pour l'établissement et l'entretien, les organoïdes sont cultivés dans des assiettes de 24 puits; pour l'assidu, dans des assiettes de 24 ou 96 puits.- préparation
- Pré-chaud déballé 24-bien plaques de culture de tissu dans un incubateur à 37 oC, 5 % CO2 au moins la nuit et de préférence 5 jours à l'avance.
REMARQUE: Le préchauffage des plaques de culture tissulaire dans l'incubateur de culture cellulaire assure la formation et l'attachement appropriés des gouttelettes organoïdes de BMM. - Pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel, préparer 1 ml d'aliquots de BMM et les stocker à -20 oC. Décongeler une fiole de BMM sur la glace au moins 30 min avant de commencer la procédure de passaging organoïde.
- Gardez un tube de 50 ml de BM sur la glace comme milieu de lavage.
- Préparer hSI-EM tel que décrit à la section 1.4, et préparer une quantité appropriée de hSI-EM-Y, par exemple, 15 mL pour une plaque complète de 24 puits.
- Pré-chaud déballé 24-bien plaques de culture de tissu dans un incubateur à 37 oC, 5 % CO2 au moins la nuit et de préférence 5 jours à l'avance.
- Recueillir des organoïdes.
- Aspirez soigneusement le milieu de culture sans déranger les gouttelettes de BMM.
- Ajouter 500 l de BM froid au premier puits d'organoïdes, et perturber les gouttelettes de BMM avec des organoïdes en pipetting doucement de haut en bas avec un tuyautphe P1000.
- Répétez cette procédure avec le même milieu dans le puits suivant comme requis, mais ne récoltez pas plus de 2 puits par 500 l'An de BM.
- Recueillir les organoïdes dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml de faible liaison et faire tourner dans une mini centrifugeuse de table pendant 15 à 20 s (max. 2 000 x g). Aspirer complètement le supernatant et retirer le dernier bit de milieu avec un tuyau P200.
REMARQUE: Lorsque les cultures d'organoïdes semblent propres au microscope et ne contiennent pas de cellules mortes ou d'autres débris, les gouttes de BMM peuvent être récoltées directement dans la trypsine au lieu de BM à l'étape 2.1.2.2. Après l'étape 2.1.2.3, passez directement à l'incubation à l'étape 2.1.3.1.
- Dissocier les organoïdes en cellules individuelles.
- Ajouter 400 ll de trypsine aux organoïdes rotatifs. Incuber les organoïdes à 37 oC pendant 5 min dans un bain d'eau.
- Perturber les agrégats restants des cellules en faisant monter et descendre doucement avec un tuyaut pestiftude. Encore une fois, incuber les organoïdes à 37 oC pendant 5 min dans un bain d'eau.
- Vérifiez l'évolution de la dissociation cellulaire au microscope à l'aide d'un grossissement 4x. Répétez la perturbation manuelle et l'incubation lorsque de gros amas de cellules subsistent.
- Lorsqu'il ne reste qu'une seule cellule, ajouter 1 ml de BM et faire tourner les cellules dans une mini centrifugeuse de table pendant 15 à 20 s.
- Aspirez complètement le supernatant. Resuspendre les cellules individuelles dans 200 l de hSI-EM frais à l'aide d'un tuyau P200. Ajouter 800 euros de hSI-EM supplémentaires.
- Comptez le nombre de cellules en suspension.
REMARQUE: Dans le laboratoire des auteurs, le comptage manuel des cellules organoïdes dissociées donne des résultats plus fiables qu'un compteur cellulaire automatisé. Lorsqu'un compteur cellulaire automatisé est utilisé, la densité cellulaire pour les applications en aval doit être testée à l'interne et ajustée si trop peu ou trop d'organoïdes se développent.
- Organoïdes de graine pour l'entretien ou l'assay de formation de gouttelettede de lipide.
- Calculer le volume de cellules qui est nécessaire pour la densité cellulaire finale.
REMARQUE: Environ 250 cellules/L est une densité appropriée. Dans une assiette de 24 puits, 30 L sont ensepépins dans chaque puits, tandis que 5 L sont enseisés dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. - Sortez le volume approprié de suspension et ajustez la densité à 750 cellules/L (ou faites-les tourner et resuspendre lorsque la densité est trop faible).
- Ajouter BMM à la suspension cellulaire dans un rapport de 2:1. La densité cellulaire finale de ce mélange est de 250 cellules/L. Mélanger délicatement la suspension par pipetting, en évitant soigneusement les bulles.
- Dans une plaque de culture de tissus réchauffée, ensemencez trois gouttelettes de 10 l par puits dans une assiette de 24 puits ou une seule gouttelette de 5 ll par puits dans une assiette de 96 puits.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 10 à 15 min pour solidifier les gouttelettes de BMM. Pendant ce temps, réchauffez-vous une quantité appropriée de hSI-EM-Y dans un bain d'eau à 37 oC.
- Ajouter délicatement 500 l de hSI-EM-Y préréchauffé à chaque puits d'une assiette de 24 puits ou de 100 l à chaque puits d'une assiette de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 oC, 5 % de CO2 et après 2 à 3 jours, changer le milieu en hSI-EM (sans Y) et rafraîchir 2 à 3 fois par semaine.
REMARQUE: Après 7 à 10 jours, une culture d'entretien des organoïdes doit être adoptée à nouveau.
- Calculer le volume de cellules qui est nécessaire pour la densité cellulaire finale.
- préparation
3. Test de formation de gouttelettes de lipide
- Préparation de la conjugaison d'acide oleique
REMARQUE : Puisque l'acide oleique (OA) est hydrophobe et non soluble dans l'eau, il est conjugué à l'albumine bovine de sérum (BSA). BSA peut lier plusieurs molécules d'acides gras et est dans ce cas utilisé dans un rapport 1:8 pour rendre l'acide oleique accessible aux cellules intestinales. Les acides gras libres et le BSA peuvent tous deux se lier aux ustensiles de laboratoire en plastique. Pour assurer une bonne concentration finale, utilisez des flacons de verre et des pipets de verre dans la mesure du possible.- Peser 0,2 g d'acide oléique liquide à température ambiante. Ajouter 1,5 ml de PBS stérile de qualité culture et chauffer le mélange à 70 oC pendant 1 h. Vortex par intermittence.
- Peser 5,89 g de BSA sans acides gras et dissoudre dans 33,9 ml de PBS. Réchauffer le mélange dans un bain d'eau à 37 oC jusqu'à ce que le BSA soit complètement dissous.
- Vortex le mélange d'OA à nouveau pour créer une émulsion de gouttelettes fines et immédiatement l'ajouter à la solution BSA à l'aide d'un tuyau en verre. Gardez la solution finale à près de 37 oC après l'ajout de l'OA. Le mélange final se compose de 20 mM OA en 2,5 mM BSA.
- Conserver le mélange à 37 oC pendant 30 min jusqu'à ce qu'il reste une solution jaunâtre claire.
- La conjugaison OA-BSA peut être indiquée et congelée à -20 oC pendant au moins 6 mois. Lors de la décongélation d'un aliquot, incubez-le à 37 oC jusqu'à ce que la nébulosité se dissolve et que le mélange soit à nouveau clair.
REMARQUE: En raison de la teneur élevée en protéines et en lipides de la solution finale, le mélange ne peut pas être stérilisé ou autoclaved. Lorsque les composants ont été manipulés avec soin, dans une hotte à débit laminaire lorsque c'est possible et à l'aide de PBS stérile, les auteurs n'ont pas connu d'infections microbiennes.
- LDF d'assay confocal
- Préparation de l'échantillon
- Organoïdes de passage tels que décrits dans la section 2.1. Ensemencez les cellules uniques d'organoïde dans une plaque noire de 96 puits à fond clair.
- Le jour 6 de la culture sur hSI-EM, remplacer le milieu de culture par hSI-EM contenant 1 mM OA-BSA conjugué.
- Incuber les cellules pendant 16 à 17 h (nuit) à 37 oC en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de 0,1 M DGAT1. Inclure un contrôle du véhicule de 2,5 mM BSA.
- Après 16 à 17 h, aspirer le milieu sans déranger les gouttelettes de BMM. Fixer les organoïdes en ajoutant 100 l de formaldéhyde tamponné neutre de 4 % aux puits pendant 30 min à température ambiante.
REMARQUE: Le formaldéhyde va partiellement dissoudre le BMM, tandis que les organoïdes s'enfoncent au fond et adhèrent au fond de la plaque. - Retirer délicatement le formaldéhyde et laver soigneusement les puits à l'œil de 150 ll de PBS par puits.
- Tainer les cellules pour les LD avec 0,025 mg/mL LD540 et 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en PBS pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Laver soigneusement les puits avec pbS.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici si nécessaire. Gardez les échantillons couverts de PBS dans l'obscurité à 4 oC. La coloration LD540 restera stable jusqu'à une semaine. Cet analyse peut également être effectué avec des cellules vivantes, pour surveiller la formation de LD sur une période de temps. Pour cela, la fixation doit être omise du protocole, et le DAPI doit être remplacé par la coloration Hoechst. LD540 peut tacher les LD dans les cellules vivantes dans la même concentration que décrite.
- Imagerie confocale
REMARQUE: L'imagerie peut être réalisée sur des échantillons d'organoïdes préparés dans la plaque noire de 96 puits à fond clair.- Pour des images d'aperçu des organoïdes entiers, utilisez un objectif 40x adapté à l'imagerie fluorescente confocale.
- Définir le microscope pour imager le canal DAPI à 405 nm excitation et vers 410-535 nm longueur d'onde d'émission. Pour le colorant LD540, choisissez un laser d'excitation à 540 nm (543 nm est optimal) et fixez les filtres d'émission à 545 à 700 nm.
REMARQUE: Dans ce protocole, un système confocal de balayage laser avec un laser de lumière blanche, un séparateur de faisceau acousto-optique (AOBS), un objectif 10x/20x, et un système de détection spectrale ont été utilisés. Cela permet d'obtenir un aperçu exact des longueurs d'onde spécifiques. Si un système comparable n'est pas disponible, choisissez des lignes laser et des filtres à courte/longue passe proches des spécifications ci-dessus. Pour l'imagerie par l'ensemble des organoïdes, une résolution de 512 x 512 ou 1024 x 1024 est suffisante pour l'analyse d'image en aval. - Définir la taille du sténopé à 1 unité aérée (AU) pour une résolution suffisamment z-axe.
- Pour imager la moitié d'un organoïde sphérique, placez une pile z à environ 85 m.
- Analyse d'image
REMARQUE: Pour l'analyse d'images, Fidji/ImageJ16,17 a été utilisé pour générer des projections maximales. L'analyse peut être effectuée avec n'importe quel logiciel d'analyse d'image qui permet une projection maximale, un seuil manuel et une analyse des particules.- À l'aide de Fidji/ImageJ, transformez la z-pile de chaque organoïde en une projection maximale : Image Piles ( Z-projet.
- Définir le seuil de la projection maximale à un niveau dans lequel il n'y a pas de signal LD540 visible dans l'échantillon de contrôle du véhicule BSA : Image Ajuster Seuil. Utilisez ces paramètres pour seuilr chaque image.
- Mesurer la zone totale de fluorescence pour chaque projection maximale à l'aide de la fonction Analyse Analyser les particules.
REMARQUE: Bien que la résolution d'analyse est préférable à l'aide d'un microscope confocal, cet analyse peut également être analysé en utilisant un lecteur de plaque fluorescente avec des filtres similaires. Pour normaliser le nombre d'organoïdes par puits, le signal LD540 doit être divisé par le signal DAPI. Enfin, le signal du contrôle du véhicule BSA doit être soustrait pour normaliser les mesures. Cette approche permet d'étendre l'action vers un format de plaque de 96 puits.
- Préparation de l'échantillon
- LDF flux cytométrique d'assay
- Préparation de l'échantillon
- Organoïdes de passage tels que décrits dans la section 2.1. Ensemencez les cellules uniques organoïdes dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Deux puits par condition sont suffisants pour la cytométrie d'écoulement.
- Le jour 10 de la culture sur hSI-EM, remplacer le milieu de culture par hSI-EM contenant 1 mM OA-BSA conjugué.
REMARQUE: Contrairement à l'analyse confocale, 10 jours de croissance en EM ont été choisis pour l'essai de cytométrie de flux au lieu de 6 jours. Les 4 jours supplémentaires d'expansion se traduiront par des organoïdes optiquement superposés qui compliqueraient l'analyse basée sur la microscopie. Cependant, le plus grand nombre de cellules facilite l'analyse de cytométrie de flux. - Incuber les cellules pendant 16 à 17 h (nuit) à 37 oC en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de 0,1 M DGAT1. Inclure un contrôle du véhicule de 2,5 mM BSA.
- Après 16 à 17 h, recueillir les organoïdes tels que décrits dans la section 2.1.2.
- Dissocier les organoïdes en cellules simples telles que décrites dans la section 2.1.3.
REMARQUE: Bien qu'il ne soit pas strictement requis, il est recommandé de vérifier le nombre de cellules dans chaque échantillon. Un nombre total de 10 000 cellules par échantillon est le minimum absolu requis pour une résolution suffisante. Pour des résultats optimaux, utilisez environ 50 000 à 100 000 cellules. - Faites tourner les cellules dans une mini centrifugeuse de table pour 15 à 20 s.
- Tainer chaque échantillon de 500 oL de 0,025 mg/mL LD540 et de 1 g/mL de Hoechst en PBS pendant 15 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Faites tourner les cellules dans une mini centrifugeuse de table pour 15 à 20 s et lavez 3x avec du PBS.
- Fixer les cellules en les rependant dans 500 L de formaldéhyde tamponné neutre de 4 % pendant 15 min à température ambiante.
- Faites tourner les cellules et lavez 3x avec un tampon FACS.
- Pré-rincez les tubes FACS avec tampon FACS pour empêcher les cellules de coller à la paroi du tube.
- Resuspendre les cellules dans 200 l de tampon FACS et transférer la suspension de la cellule aux tubes FACS pré-rincés.
- Analyse cytométrique de flux
- Définir les paramètres de gating pour exclure les cellules mortes et les amas de cellules (voir la section des résultats représentatifs).
- Dans la population fermée finale, mesurez au moins 10.000 cellules pour des résultats fiables.
REMARQUE: De cette population, l'intensité fluorescente moyenne (IMF) de LD540 et le signal SSC-A moyen ensemble fournissent une mesure du volume total de la formation de LD par cellule.
- Préparation de l'échantillon
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Representative Results
Pour l'analyse appropriée de la formation de LD, les organoïdes ne devraient pas être ensemencés trop densément avant la stimulation avec l'arthrose et la coloration suivante. Ceci est particulièrement important pour la lecture confocale et de lecteur de plaque, puisque les organoïdes qui se chevauchent pourraient interférer avec la fluorescence. Un exemple de densité d'ensemencement organoïde appropriée (Figure 1A) et une culture avec des organoïdes qui se chevauchent est montré (Figure 1B). Pour minimiser la variabilité de la stimulation de l'échantillon avec l'arthrose, la taille des organoïdes et la densité d'ensemencement devraient être comparables entre les échantillons au sein d'une expérience. Ceci est mieux contrôlé par l'ensemencement d'un nombre égal de cellules individuelles. Cependant, certains ajustements pourraient être nécessaires si certaines lignées organoïdes montrent systématiquement une efficacité de reconstitution plus élevée et donc un nombre d'organoïdes toujours plus élevé.
Après stimulation avec 1 mM d'arthrose pendant la nuit, la formation de LD peut être visualisée avec un microscope inversé de brightfield. L'accumulation de LD disperse la lumière transmise, et donc les organoïdes semblent plus sombres, tandis que les organoïdes non stimulés ont un aspect translucide (Figure 1C). Un exemple de formation de LD vu sous un microscope de brightfield est montré dans la figure 1D. Ce phénomène peut être utilisé pour évaluer les conditions expérimentales avant la lecture d'analyse fluorescente. Lorsque l'échantillon témoin positif n'est pas visuellement plus foncé que l'échantillon témoin négatif, ou lorsque la mort cellulaire importante est apparente, l'expérience doit être écartée. Comme les AFF sont toxiques pour les cellules en concentrations plus élevées, et que la concentration létale diffère d'une espèce de FFA, la concentration sublétale optimale qui induit la formation de LD devrait être titrée pour chaque application.
Une fois que les organoïdes stimulés par l'arthrose sont fixes et tachés selon le protocole, le LDF peut être visualisé à l'aide d'un microscope confocal. Comme les organoïdes sont des structures 3D, un microscope épifluorescent régulier n'est pas approprié en raison du signal de fond hors foyer. Par conséquent, nous avons utilisé une (projection maximale d'un) z-pile confocal pour caractériser LDF dans les organoïdes. La figure 2A montre un résultat représentatif de la coloration LD dans des organoïdes témoins sains qui ont été traités avec ou sans inhibiteur de DGAT1. Bien que la quantification de ces images soit laborieuse, l'analyse confocale sert principalement d'outil de visualisation pour vérifier la formation anormale de LD. La quantification des échantillons de microscopie confocale peut également être effectuée à l'aide d'un lecteur de plaques fluorescentes (figure 2B),normalisé au signal fluorescent Hoechst. L'exemple de lecteur de plaque indique une diminution significative du signal LD540 dans les cellules organoïdes traitées avec l'inhibiteur d'IGC1 (D1i) par rapport aux organoïdes non traités.
Quantification de la formation de LD dans les cellules individuelles peut être réalisée en utilisant le cytomètre de flux. La stratégie de gating utilisée pour les organoïdes intestinaux humains dissociés est montrée dans la figure 3A. La première étape du gating dans l'intrigue FSC-A/SSC-A est une première sélection de cellules individuelles « vivantes » (lorsqu'elles sont fixées). Pour exclure davantage les doublets, les triplets ou les amas cellulaires plus gros, nous avons inclus deux étapes de gating supplémentaires sur FSC-W/FSC-H et SSC-W/SSC-H. Enfin, le gating sur FSC-A/Hoechst assure l'exclusion de toutes les cellules qui étaient mortes ou mourantes avant la fixation. La figure 3B,C montre les histogrammes du signal SSC-A et du signal LD540 de la population finale de cellules vivantes. LDF se traduira par une augmentation de SSC-A en raison de la formation de gouttelettes lipidiques intracellulaires. En outre, les taches LD540 pour les lipides qui sont stockés dans les LD et ce signal augmentera également lors de l'induction LDF. À ce titre, la formation DeL est mesurée comme un changement dans l'IMF de SSC-A et de LD540(figure 3D,E). L'IMF peut être tracée et utilisée pour effectuer une analyse statistique.
Figure 1 : Cultures organoïdes visualisées par microscopie des champs lumineux. (A,B) Pour les méthodes de lecteur de plaques confocales et fluorescentes, il est important que les organoïdes ne soient pas enseisés dans une densité trop élevée dans la gouttelette BMM. (A) Les organoïdes sont ensedus dans une densité appropriée de 250 cellules/L. (B) Les organoïdes ont été ensedus dans une densité trop élevée, causant le chevauchement des organoïdes et la mort cellulaire. (C,D) Après la stimulation de nuit avec l'arthrose, la formation de LD peut être évaluée visuellement. (C) Les organoïdes ont été incubés pendant la nuit avec 12% de contrôle du véhicule BSA. (D) Les organoïdes ont été incubés pendant la nuit avec 1 mM d'arthrose conjugué à bSA, ayant pour résultat un aspect foncé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Résultats représentatifs de la caractérisation du FDL à l'aide d'une imagerie confocale et d'un lecteur de plaques fluorescentes. Des organoïdes sains dérivés du contrôle ont été stimulés pendant la nuit avec bSA, 1 mM OA, ou 1 mM OA-D1i. (A) Projection maximale de 85 piles confocales de 85 m tachées pour DAPI (cyan) et LD540 (jaune). Cette sous-figure est adaptée de van Rijn et coll.6. (B) Intensité relative de fluorescence de LD540 normalisée au signal nucléaire d'API tel que mesuré en utilisant un lecteur fluorescent de plaque. Moyenne - SD est tracé pour deux répliques biologiques. L'importance statistique a été déterminée à l'aide d'un ANOVA à sens unique sans mesures répétées avec un Tukey post-hoc. P lt; 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats représentatifs de la quantification du FLD à l'aide de la cytométrie du débit. Des organoïdes sains dérivés du contrôle ont été stimulés pendant la nuit avec bSA, 1 mM OA, ou 1 mM OA-D1i. (A) Stratégie de gating pour sélectionner pour les cellules uniques organoïdes-dérivées. De gauche à droite, excluez d'abord les débris en gating pour FSC-A/SSC-A. Puis portez sur FSC-W/FSC-H et SSC-W/SSC-H pour exclure les doublets, les triplets ou les touffes de cellules plus grandes. Enfin, porte pour FSC-A/Hoechst à sélectionner pour les cellules vivantes. Les canaux SSC-A et LD540 sont utilisés pour quantifier la formation de LD. Les histogrammes de ces paramètres montrent un changement dans l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de (B) SSC-A et (C) LD540 lors de la stimulation avec l'arthrose. (D,E) L'IMF par échantillon peut être tracée dans un graphique et utilisée pour effectuer une analyse statistique. Moyenne - SD est tracé pour trois répliques biologiques. L'importance statistique a été déterminée à l'aide d'un ANOVA à sens unique sans mesures répétées avec un Tukey post-hoc. P lt; 0,05; P et lt; 0,01; , P et lt; 0,001. Ce chiffre est adapté de van Rijn et coll.6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| produit chimique | solvable | Concentration des stocks | Concentration finale |
| CM Wnt3a | - | 100% | 50% |
| R-spondin-1 CM | - | 100% | 20% |
| Noggin CM | - | 100% | 10% |
| A83-01 (TGF-inh) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 (en) | - | 50x 50x | 1x 1x |
| MEGF (en) | PBS/0,1% BSA | 500 g/mL | 50 ng/mL |
| N-acétyl | eau | 500 mm | 1,25 mM |
| Nicotinamide | Pbs | 1 M | 10 mM |
| Primocin (utiliser jusqu'à ce que MCB soit au congélateur) |
- | 50 mg/ml | 100 g/mL |
| SB202190 (P38 inh) | Dmso | 30 mM | 10 M |
Tableau supplémentaire 1 : Recette pour le milieu d'expansion d'organoïde.
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Discussion
Ici, nous fournissons un protocole pour déterminer la formation de LD dans les organoïdes intestinaux humains lors de l'incubation avec l'acide oleique. Cette méthode est basée sur le colorant fluorescent LD54018, qui permet de caractériser et de quantifier le volume total de gouttelettes lipidiques dans une culture organoïde. Les procédures d'établissement et de maintien des cultures d'organoïdes intestinaux humains ont été publiées avant13, et un guide visuel de ce protocole est disponible ainsi15.
Les étapes cruciales dans ce protocole sont la culture des organoïdes intestinaux humains, et la conjugaison appropriée de l'arthrose à la BSA. La culture des organoïdes nécessite une formulation correcte du milieu de culture, car le maintien d'une population de cellules souches dépend fortement du Wnt3A-CM fonctionnel. Lorsque Wnt3A-CM est fabriqué à l'interne, nous recommandons un flux de travail hautement standardisé et la production mensuelle de milieu conditionné en raison du temps d'expiration d'environ 2 mois. En outre, le mélange 1:1 de lots consécutifs Wnt3A-CM se traduit par une culture à long terme plus constante, car il garantit qu'un lot légèrement sous-optimal n'aura pas un impact majeur sur la croissance des organoïdes.
En outre, notre BM se compose de milieu avancé DMEM/F12, qui contient de la BSA riche en lipides. Puisque le contrôle de notre véhicule (12% BSA/BM) n'induit pas la formation de LD dans les organoïdes, nous concluons que la quantité ou le type de FFA dans BM n'est pas suffisant pour influencer l'assay de LDF.
La conjugaison de l'arthrose à la BSA est un processus délicat qui pourrait nécessiter une certaine optimisation. Nous avons constaté que le protocole décrit ici est le plus optimal lorsque tous les changements de température sont suivis méticuleusement et lorsqu'ils sont exécutés à l'aide de verre labware.
Dans des recherches antérieures, les essais de formation LD ont été utilisés pour caractériser la taille et le nombre LD avec un grossissement élevé8,12. Ces essais ont été principalement effectués en utilisant le bore-dipyrromethene (BODIPY) 493/503, qui fournit une excellente coloration pour les LD avec un rapport signal-bruit élevé. Cependant, le spectre d'émission de BODIPY est assez large, et chevauche largement avec le spectre fluorescent des colorants fluorescents dérivés de la protéine fluorescente verte (GFP). Bien que nous nous attendions à ce que l'application actuelle de l'assay LDF fonctionnerait avec BODIPY ainsi, le choix pour LD540 permet un plus large éventail d'images multicolores, y compris la co-coloration avec les étiquettes GFP18. Nous avons également effectué cet analyse en utilisant la tache lipidique Rouge Nil (données non montrées). Cependant, puisque le rouge du Nil a tendance à tacher non seulement les LD mais aussi les bicouches lipidiques, nous avons constaté que le signal de fond plus élevé du rouge du Nil abaisse la capacité de notre analyse pour distinguer de petites différences de formation de LD. Pour ces raisons, nous préférons utiliser LD540 dans un exemple de LDF à base d'organoïdes.
Comparé aux études antérieures utilisant des essais de LDF de grossissement élevé, l'analyse que nous décrivons ici permet la quantitation à haut débit du volume total de LD dans une grande population de cellules. Par conséquent, en particulier la quantitation de lecteur de plaque fluorescente, et potentiellement l'analyse cytométrique de flux, peut être mise à l'échelle pour tester l'effet des drogues sur la formation de LD. Comme nous avons montré que la formation de LD est en grande partie DGAT1 dépendante, les organoïdes d'origine patiente ou D1i-dérivés de DGAT1 représentent une occasion claire pour l'application d'un tel criblage. Particulièrement pour de telles maladies rares, l'essai de LDF combiné avec les organoïdes patient-dérivés pourrait fournir une plate-forme pour le dépistage patient-spécifique pour de nouveaux médicaments thérapeutiques.
Cependant, une conséquence d'une approche à haut débit est que le pouvoir de caractériser les LD individuels est perdu. Bien que la visualisation microscopique ou fluorescente de l'électron à haute grossissement des LD puisse être utilisée pour étudier la dynamique de la taille du LD et du nombre12,19, l'approche à haut débit ne fait pas de distinction entre plusieurs petits ou moins grands LD et ne peuvent donc pas être utilisés pour quantifier les différences dans le métabolisme LD où pour le volume total de LDs reste constante. Par conséquent, dans les applications où le nombre ou la taille des LD sont soupçonnés d'être d'intérêt, cela devrait être abordé avec un faible débit, technique de grossissement plus élevé. En outre, les organoïdes dans l'assay courant reçoivent la stimulation basolatérale de lipide tandis que les lipides diététiques sont typiquement pris vers le haut à la membrane apical. Une certaine prudence est donc nécessaire si l'on veut traduire les résultats sur la situation physiologique.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions B. Spee d'avoir généreusement fourni LD540. Ce travail a été soutenu par une subvention de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) à S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
