Presenteras här är ett protokoll för användning av alginat som en polymer i microencapsulation av förevigade celler för långsiktig leverans av biologiska läkemedel till gnagare ögon.
Många nuvarande therapeutics under utveckling för sjukdomar i den bakre polen i ögat är biologiska. Dessa läkemedel måste administreras ofta, vanligtvis via intravitreal injektioner. Inkapslade celler som uttrycker det biologiska valet håller på att bli ett verktyg för lokal proteinproduktion och proteinfrisättning (t.ex. via långvarig läkemedelstillförsel). Dessutom, inkapsling system använder genomsläppliga material som tillåter spridning av näringsämnen, avfall, och terapeutiska faktorer i och ut ur celler. Detta inträffar vid maskering av cellerna från värdens immunsvar, undvika behovet av undertryckande av värdimmunsystemet. Detta protokoll beskriver användningen av alginat som en polymer i mikrokapsling i kombination med elektrospraymetoden som en mikroencapsulationsteknik. ARPE-19 celler, en spontant förekommande mänskliga RPE cellinje, har använts i långsiktiga experiment cellterapi på grund av dess livstid funktionalitet, och det används här för inkapsling och leverans av kapslarna till mus ögon. Manuskriptet sammanfattar stegen för cellmikroinkapsling, kvalitetskontroll och okulär leverans.
Cellbaserade terapier representerar revolutionerande biologiska tekniker som har tillämpats i stor utsträckning inom medicinen. Nyligen har de framgångsrikt tillämpats vid behandling av neurodegenerativa sjukdomar, ögonsjukdomar och cancer. Cellterapier täcker ett brett spektrum av områden från cellersättning till läkemedelsleverans, och detta protokoll fokuserar på det senare. Biologiskt nedbrytbara alginatmikrokapslar (MC) har visat effektivitet som ett leveranssystem, och de blir allmänt används inom det biomedicinska området. Alginat har använts i mikroinkapsling på grund av sin enkla geleringsprocess, biologisk nedbrytbarhet, utmärkt biokompatibilitet och stabilitet under in vivo-förhållanden1,,2,,3,4.
Elektrospraymetoden, som en mikroinkapslingsteknik, har framgångsrikt använts för att kapsla in peptider och proteiner med alginat (baspolymer) och poly-l-ornitin (sekundär beläggningspolymer). Båda polymererna är naturligt förekommande och används för deras biokompatibilitet5,,6,7. Emellertid, den största utmaningen i cellbaserade terapier är undertryckande av värd immunsystemet för att undvika biverkningar orsakade av immunsuppressiva läkemedel. Permeabiliteten av alginatmikrokapslar anses vara en lämplig egenskap för cellinkapsling, vilket möjliggör spridning av näringsämnen, avfall och terapeutiska faktorer till och från celler samtidigt som de maskeras från värdens immunsvar8,9,10.
I ögat har inkapslade celler använts i kliniska prövningar för konstant leverans av biologiska läkemedel (dvs. tillväxtfaktorer11,,12 och tillväxtfaktorantagonister13) för behandling av retinitis pigmentosa eller åldersrelaterad makuladegeneration. Andra mål såsom komplementhämmare14 undersöks också för närvarande i prekliniska miljöer.
Denna cell inkapsling teknik är relativt snabb och lätt att utföra; Vissa punkter måste dock beaktas för att uppnå korrekta resultat i senare led. Celler bör upprätthållas i kultur i en petriskål före inkapsling och hållas på rätt konfluensa. Inkapsling bör utföras i en ordentlig ventilationsfläkt med reglerat luftflöde, om möjligt. För stark av en luftström kan påverka kapselbildning, särskilt i långsiktiga experiment. Sterila redskap och lösningar är avgörande för långsiktigt underhåll av …
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes delvis av bidrag som tilldelats B. R. av National Institutes of Health (R01EY019320), Department of Veterans Affairs (RX000444 och BX003050), och South Carolina SmartState Endowment.
3 mL Syringe | BD | 309656 | |
30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
HEPES buffer, 1M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
Sterile syringe filters, 0.2 um | VWR | 28143-312 | |
Syringe pump | GRASEBY | MS16A |