Поколение гетерогенных градиентов наркотиков по всей популяции рака на микрофлюидной эволюции ускоритель для наблюдения в режиме реального времени
Summary
Мы представляем микрофлюидную модель рака на чипе, технологию “Evolution Accelerator”, которая обеспечивает управляемую платформу для долгосрочных количественных исследований динамики рака в четко определенных условиях окружающей среды в одноклеточных условиях Уровень. Эта технология, как ожидается, будет работать в качестве модели in vitro для фундаментальных исследований или доклинической разработки лекарственных средств.
Abstract
Традиционная клеточная культура остается наиболее часто используемой доклинической моделью, несмотря на доказанную ограниченную способность прогнозировать клинические результаты рака. Для преодоления разрыва между упрощенными традиционными 2D-культурами и более сложными моделями животных, которые имеют ограниченные возможности для получения надежных и воспроизводимых количественных результатов, были предложены модели микрофлюидного рака на чипе. Здесь мы представляем микрофлюидную модель рака на чипе, которая воспроизводит ключевые компоненты сложной микросреды опухоли комплексным образом, но достаточно проста, чтобы обеспечить надежные количественные описания динамики рака. Эта микрофлюидная модель рака на чипе, “Эволюция ускоритель”, разбивает большую популяцию раковых клеток на взаимосвязанный массив микросреды опухоли, генерируя неоднородный химиотерапевтический стресс ландшафта. Прогрессирование и эволюционная динамика рака в ответ на градиент препарата могут контролироваться неделями в режиме реального времени, а многочисленные эксперименты вниз по течению могут быть выполнены в дополнение к замедленному снимкам, сделанным в ходе экспериментов.
Introduction
Рак все шире признается в качестве сложной экосистемы, которая зависит не только от продолжающейся дисрегуляции мутировавших популяций клеток, но и от жизненно важных взаимодействий между раковыми клетками и микроокружением хозяев. В этом смысле рак развивается на адаптивном ландшафте, проявляемом сочетанием факторов, включая разнородную микроокружение опухоли и перекрестный разговор с различными клетками-хозяинами, все из которых способствуют селективному давлению для дальнейшего генетического или эпигенетические изменения1,2,3. В контексте твердых опухолей неравномерное распределение химиотерапевтических и других градиентов ресурсов способствует их молекулярной неоднородности и может играть роль в развитии лекарственной устойчивости, повышенном ангиогенезе к конкретной опухоли субпопуляций, и даже метастаз4,5,6. Обычные исследования культуры 2D-клеток in vitro, обладающие крупномасштабными, удобными экспериментальными возможностями, обеспечивают среднее поле, единую и фикчированную условия, часто не имея точного пространственного и временного экологического контроля, необходимого для подлинного эмулировать динамику опухоли in vivo. Таким образом, существует необходимость в более репрезентативных моделях ex vivo для воспроизведения микроокружения опухоли до животных моделей в конвейере разработки лекарств для лучшего прогнозирования прогрессирования рака, а также реакции на лекарства в динамическом стрессе Пейзажи. Микрофлюитики были предложены для преодоления разрыва между 2D исследования культуры клеток и более сложные исследования in vivo животных, которые не могут быть в состоянии поддерживать контролируемые количественные исследования7,8,9.
Идеальная система in vitro для характеристики динамики раковых клеток должна обладать способностью генерировать неоднородную микросреду для имитации адаптивных клеточных реакций, которые могут иметь место в опухоли, а также позволяют наблюдать за этой динамикой на одноклеточное разрешение. В этой статье мы описываем микрофлюидную платформу культуры клеток, устройство на основе PDMS под названием “Эволюция ускоритель” (EA), что позволяет параллельно в пробирке исследования динамики раковых клеток при клеточном разрешении с получением данных в режиме реального времени над течение недель, в то время как устойчиво поддержания градиентов стресса по всей культуре ландшафта. Дизайн этой платформы основан на нашей предыдущей работе, в которой эволюционная динамика организмов в метапопуляции может быть ускорена10,11. В частности, в группе пространственно разделенных популяций, которые взаимодействуют на определенном уровне, при воздействии неоднородного стрессового ландшафта, наиболее подходящие виды могут доминировать в местной популяции быстрее по сравнению с большой равномерной популяцией. Затем выгодные виды мигрируют в соседние микрохабиты в поисках ресурсов и пространства, и в конечном итоге доминируют над всей популяцией. Как показано на рисунке 1, картина микрофлюидного чипа EA состоит из (i) пары серпантинных каналов, которые обеспечивают свежую циркуляцию носителей и строят фиксированные пограничные условия для химической диффузии, и (ii) область культуры шестиугольных клеток которая состоит из 109 взаимосвязанных шестиугольных и 24 полугексагональных камер в центре, напоминающих сотовую структуру. Глубина чипа составляет 100 мкм. Медиа-каналы и область клеточной культуры связаны с небольшими щелями (около 15 мкм в ширину), которые предотвращают прямой поток носителей и результирующее напряжение сдвига в области клеточной культуры, но все же позволяют химическим веществам распространяться через небольшие щели и обмениваться питательными веществами, метаболических отходов и т.д. Поколение химических градиентов демонстрируется на рисунке 1B, где один медиа-канал содержит 0,1 мМ флуоресцеина, в то время как другой канал свободен от флуоресцеина. Клетки культивируются на газопроницаемой мембране, инкапсулированной микроструктурами через положительное давление спины на мембрану против чипа. Компоненты держателя устройства иллюстрируются на рисунке 2, и экспериментальная установка иллюстрируется на рисунке 3, где культура поддерживается на перевернутом микроскопе при 37 градусах Цельсия, с более чем 85% относительной влажностью, и обусловлена нормоксийный газокомпозиция.
Эта система обеспечивает детальное наблюдение локализованных клеточных взаимодействий через ярко-полевые и флуоресцентные каналы и позволяет пространственно-решено вниз по течению assays, таких как иммунофлуоресценция, Западная поместья, или масс-спектрометрии. Ранее мы продемонстрировали в качестве доказательства принципа этой микрофлюидной модели рака на чипе на долгосрочной совместной культуры эпителиальных и мезенхимальных раковых клеток предстательной железы PC312, а также появление лекарственной устойчивости полиплоидных гигантских гигантских раковые клетки с помощью эпителиальной линии клеток PC313. В то время как мы представляем применение этой платформы, чтобы понять пространственно-временной динамики эпителиальных PC3 и мезенхимальных раковых клеток простаты под градиентом стресса доцетаксел, микрофлюидная система может быть легко применена к любой комбинации клеточных линий и ресурсные (т.е. лекарственные, питательные вещества, кислородные) градиенты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционная клеточная культура была разработана почти сто лет назад и остается наиболее часто используемой доклинической моделью в биомедицинских исследованиях, несмотря на доказанную ограниченную способность предсказывать клинические результаты при раке17. Модели жи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
