Optisk avbildning av isolert murine ventrikkel myocytter

Summary

Vi presenterer metodikk for isolering av murine myocytter og hvordan du skaffer spenning eller kalsium spor samtidig med sarkomerlengde forkorte spor ved hjelp av fluorescens fotometri med samtidige digitale celle geometri målinger.

Abstract

Evnen til å isolere voksen CARDIAC myocytter har tillatt forskere å studere en rekke CARDIAC patologi på enkelt cellenivå. Mens fremskritt i kalsium følsomme fargestoffer har tillatt den robuste optiske innspillingen av enkelt celle kalsium dynamikk, opptak av robuste transmembrane optiske spennings signaler har vært vanskelig. Uten tvil, dette er på grunn av den lave enkelt-til-støy-forhold, Phototoksisitet, og photobleaching av tradisjonelle potensiometrisk fargestoffer. Derfor har én celle spennings målinger lenge vært begrenset til plasteret klemme teknikk som mens gullstandarden, er teknisk krevende og lav gjennomstrømming. Men med utviklingen av romanen potensiometrisk fargestoffer, store, raske optiske reaksjoner på endringer i spenning kan fås med liten eller ingen Phototoksisitet og photobleaching. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du isolerer voksen murine myocytter som kan brukes for mobilnettet forkortelse, kalsium, og optisk spenning målinger. Nærmere bestemt beskriver protokollen hvordan du bruker en ratiometrisk kalsium fargestoff, en enkelt-eksitasjon kalsium fargestoff, og en enkelt eksitasjon spenning fargestoff. Denne tilnærmingen kan brukes til å vurdere Kardiotoksisitet og arrhythmogenicity av ulike kjemiske stoffer. Mens Phototoksisitet er fortsatt et problem på enkelt cellenivå, er metodikk diskutert om hvordan å redusere den.

Introduction

For å studere hjertet under sunne og patologiske tilstander, er det ofte nyttig å undersøke fenotype på enkelt cellenivå. Mens vitenskapelige fremskritt har tillatt den robuste måling av enkelt celle kalsium dynamikk, har én celle optisk spenning målinger forble knappe¹. Uten tvil, dette er på grunn av det lave signalet til støyforhold (SNR), Phototoksisitet, og photobleaching av tradisjonelle potensiometrisk fargestoffer^2,3. Likevel har isolert myocyte optisk handling potensialer blitt innhentet^2,3,4. Videre, med fremskritt innen kjemi og fysikk av spennings følsomme fargestoffer, har SNR forbedret⁵. Nyere membran potensielle sonder (tabell av materialer) reagerer på endringer i membran potensialet i sub-millisekunder og har et fluorogenic respons område på ca. 25% per 100 mv. Videre eksitasjon/utslipp av membranen potensialet Kit (f. eks FluoVolt; Tabell med materialer) brukes i denne protokollen fungerer med standard fluorescein isothiocyanate (FITC) eller grønt fluorescerende protein (GFP) innstillinger⁶.

FITC og GFP eksitasjon/utslipp Spectra overlapper med fluo-4 kalsium bundet Spectra⁷. Samtidig anskaffelse av fluorescens fotometri med digitale celle geometri målinger tradisjonelt har blitt brukt for samtidig anskaffelse av kalsium og cellulære forkorte målinger⁸. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du isolerer murine myocytter og hvordan du registrerer kalsium-eller spennings signaler ved hjelp av standard FITC-innstillinger. I tillegg beskriver det hvordan en enkel bryter i eksitasjon/utslipps filtre på Imaging arbeidsstasjonen kan brukes til å få kalsium og forkorte målinger ved hjelp av forholdet metrisk kalsium fargestoff fura-2. Sammenlignet med fluo-4, har fura-2 en høyere affinitet for kalsium og er relativt motstandsdyktig mot photobleaching⁹. Følgelig, ved hjelp av en enkelt arbeidsstasjon denne protokollen gir en grundig undersøkelse av enkeltvis myocyte eksitasjon-sammentrekning kopling.

Protocol

Alle metoder og prosedyrer som er beskrevet i denne protokollen har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Case Western Reserve University. 1. utarbeidelse av løsninger, instrumenter og Coverslips Merk: 1x-løsninger kan brukes i opptil en måned. Lag 10x Krebs-Henseleit buffer HEPES buffer uten kalsium (KHB-HB) ved å legge 68,96 g av NaCl, 3,57 g av KCl, 59,58 g av HEPES, 2,18 g av K2HPO4, 3,08 g av MgSO4 og 19,82 g av glukose til 800 ml dobbel destillert vann i en 1 000 ml kolbe. Etter at innholdet er fullstendig oppløst, ta opp til volum i en 1 000 mL volum kolbe.Merk: tradisjonell Krebs Henseleit løsning bruker natrium bikarbonat som en buffer og løsningen i denne protokollen bruker Krebs Henseleit løsning med HEPES buffer. Løsningen er stabil i 6 måneder hvis steril filtrert. Lage 10x Tyrode ‘ løsning av tilføyer 86,51 g av NaCl, 0,552 g av NaH2PO4, 2,03 g av MgCl2, 9,91 g av glukose, 4,03 g av KCl, 2,65 g av CaCl2, og 35,76 g av HEPES å 800 mL av dobbel destillert vann i en 1000 ml kolbe. Etter at innholdet er fullstendig oppløst, ta opp til volum i en 1000 mL volum kolbe.Merk: løsningen er stabil i 6 måneder hvis steril filtrert. Lag 1x KHB-HB ved å måle ut 100 mL av 10x lager og legge til 875 mL av dobbelt destillert vann i en 1 000 mL kolbe. Plasser kolbe i 37 vannbad. Når løsningen har nådd 37 ° c, bruker du NaOH for å øke pH-verdien til 7,39. Etter justering av pH, bringe løsningen til volum i en 1000 mL volum kolbe. Sterilt filter løsningen ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Lag 1x Tyrode løsning ved å måle ut 100 mL av 10x lager og legge til 875 mL dobbel destillert vann i en 1 000 mL kolbe. Plasser kolbe i 37 vannbad. Når løsningen har nådd 37 ° c, bruker du NaOH for å øke pH-verdien til 7,39. Etter justering av pH, bringe løsningen til volum i en 1 000 mL volum kolbe. Sterilt filter ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Foreta 1x modifisert Tyrode løsning ved å måle ut 100 mL av 10x lager og legge til 875 mL dobbel destillert vann i en 1 000 mL kolbe. Løs opp 3,07 g av L-glutation redusert i kolbe. Plasser kolbe i 37 vannbad. Når løsningen har nådd 37 ° c, bruker du NaOH for å øke pH-verdien til 7,39. Etter justering av pH, bringe løsningen til volum i en 1 000 mL volum kolbe. Sterilt filter løsningen ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Lag 100 mM blebbistatin lagerløsning ved å tilsette 855 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) til 25 mg pulver. Alikvot ut i 20 μL-trinn og oppbevar i en-80 ° c fryseboks i opptil seks måneder. Gjør stoppe buffer ved å legge 2 g av storfe serum albumin (BSA) og 1 hetteglass med aliquoted blebbistatin lager til 100 mL 1x KHB-HB og sterilt filter løsningen ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Gjør plating buffer ved å legge 5 mL av fosterets storfe serum og 1 hetteglass av aliquoted blebbistatin lager til 95 mL M199 HEPES. Sterilt filter løsningen ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Lag myocyte kultur buffer ved å legge til ett 1 hetteglass med aliquoted blebbistatin lager og 4 MLS penicillin-Streptomycin til 396 mL M199 (25 mM HEPES). Sterilt filter løsningen ved hjelp av et vakuum filtreringssystem. Autoklav 2 parene av Dumont pinsett, 2 par Iris buet saks, 2 hemostats, ett par av plastisk kirurgi tang, 6 svart flettet silke 4-0 sting arrangert for å brukes som en kirurgisk dobbel-kast knute, og 4 100 mL kanner. Sterilisere 22 x 22 mm2 glass coverslips. Først plasserer en enkelt dekkglass i hver brønn av en seks brønn plate. Etterpå, med lokket fjernet, slå på UV-lampen på biosafety skapet og utsett coverslips for UV-lys for 1 t. Gjør arbeidet laminin lagerløsning ved først å tine flasken på isen. Legg innholdet i en flaske til nok kaldt sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) for å nå en endelig konsentrasjon på 0,04 mg/mL. Alikvot ut 1,3 μL til autoklaveres 1,5 mL sentrifugerør. Store ved-80 ° c.Merk: hvert rør har nok laminin for en enkelt seks brønn plate. Unngå flere fryse tine sykluser. Coat sterilisert dekkglass ved først å tine arbeids laminin løsning på isen. Ved hjelp av en P1000 pipette, aspirer 200 μL av laminin. Dra forsiktig dråpe spissen langs den ene kanten av dekkglass for å tillate kapillær handling å trekke ut en minimal mengde laminin for å lette dekkglass vedlegg til de seks brønn platene. Deretter, utvise de resterende laminin i midten av dekkglass. I en sirkulær bevegelse sprer du laminin dråpe over dekkglass. Plasser i en 37 ° c inkubator minst 1 time og opptil 24 timer før isolasjonen. 2. utarbeidelse av Langendorff apparat Merk: de enkelte komponentene i Langendorff-apparatet som brukes i denne protokollen, er listet opp i materialfortegnelsen. Slå på sirkulerende vannbad. Innstilt temperatur slik at perfusate har en temperatur på 37 ° c.Merk: med løsnings reservoarene satt til en høyde på 60 cm, må sirkulasjons Waterbirth settes til 41 ° c for at perfusate skal være 37 ° c. I motsetning til tidligere rapporterte protokoller trenger ikke høyden på reservoaret endres. Skyll Langendorff apparatet med 70% etanol etterfulgt av to skyllinger med autoklaveres dobbelt destillert vann. Etter skylling fylles reservoaret med KHB-HB og oxygenate med 100% oksygen. Prime systemet ved at oksygenert KHB-HB til første strømme inn i et 100 mL beger. Når 50 mL oppløsning har strømmet inn i begeret, Bytt 3-veis stopp-kuk posisjon for å stoppe strømmen fra KHB-HB reservoaret. Hell 50 mL oksygenrikt KHB-HB fra begeret inn i kollagenase reservoaret. La KHB-HB renne fra fordøyelsen reservoaret til 5 mL forblir i kollagenase reservoaret. Mens priming kollagenase reservoaret, slå på 3-veis stopp kuk gjentatte ganger mellom reservoarer for å tillate linjene å Degas. Etter at systemet er primet, husk å bruke avgassing fellen plassert på toppen av varme spiral slik at eventuelle gjenværende luft for å avslutte systemet. Gjør den kollagenase løsningen. For rotter kombinerer 100 mg av type II-kollagenase, 100 mL oksygenrikt KHB-HB og 2 hetteglass med blebbistain lager. For mus, Kombiner 100 mg av type II-kollagenase, 40 mL oksygenrikt KHB-HB og 2 hetteglass med blebbistain lager. Når blandet, bør løsningen være stabil for 1 time.Merk: Myocyte levedyktighet kan variere mellom type II kollagenase tomter. Dra nytte av et kollagenase sampling program for å teste mye før bulk bestilling. 3. Myocyte isolasjon Injiser dyret med 1 000 U av heparin. Vent 5 min.Merk: mus og rotter i alle aldre kan brukes. Imidlertid, i alminnelighet det eldre eller flere syk det dyr, det lavere det myocyte utbytte. Ofring dyret av for det første anesthetizing den med isoflurane benytter det åpen-miste metoden (1 cc av isoflurane per 500 CC kvantum) tidligere euthanizing det dyr med en pentobarbital blanding (150 mg/kilos intraperitoneal). Raskt avgiftsdirektoratet hjertet ved først å ta tak i pelsen over xiphoid prosessen. Med Iris saks, lage et lite snitt rett under xiphoid prosessen og trekke pelsen oppover mot hodet utsette huden. Grip xiphoid prosessen og kutt membranen utsette bryst hulrommet. Lag en felle dør snitt, trekke brystbenet tilbake ved hjelp av en hemostat, og bruke den buede tang til forbrukeravgift hjertet over stigende aorta og sted i kaldt KHB-HB. Kannelerer hjertet ved hjelp av et stereo mikroskop og nummer 5 tang. Pass på at hjertet er under vann og kanyle ble primet før hjertet forbruker for å hindre lungeemboli. Bekreft riktig posisjonering av kanyle ved å visualisere tuppen av kanyle ca. 1 mm over aorta innsetting i ventrikkel.Merk: jo raskere kanyleringen tid, jo bedre myocyte yield. Start flyten av KHB-HB ved å dreie stopcock på Langendorff. Koble kanyle til Langendorff. Perfuse hjertet i 5 min.Merk: siden blodtilførsel er levert av et tyngdekraft BAS ert system, vil flyten gjennom hjertet være en funksjon av koronar overholdelse. Bytt fra KHB-HB-reservoaret til buffer beholderen for fordøyelsen. Når fordøyelsen buffer når hjertet, sette en tidtaker (5 min for mus eller 15 min for rotte). Sørg for å samle perfusate i et sterilt 100 mL beger. Fyll på fordøyelsen buffer reservoaret etter behov med perfusate til fordøyelsen tiden er utløpt. Etter fordøyelsen, skille kamre av hjertet med tang og Iris saks i et sterilt 100 mL beger. Plasser hvert kammer i en egen brønn av en seks brønn plate. Hell 5 mL kollagenase oppløsning i hver brønn. Umiddelbart starte hakking hjertet vev ved hjelp av saks. Vevs deler bør være ca 1 mm3. Bruk av sterile overførings Pipetter, forsiktig triturate i hakket hjerte vev. Oppløsningen skal bli uklar. Når vevet biter blir hvite og fjærlett, undersøke cellene ved hjelp av en invertert mikroskop. Hvis antall levedyktige celler er større enn 80%, Fortsett å stamme cellene til en 50 mL konisk rør ved hjelp av en 100 μm celle sil. Bruk et annet rør og sil for hvert kammer av hjertet. Hvis antall levedyktige celler er mindre enn 80%, sjekk tiden det tok å kannelerer. Hvis kanyleringen tiden er over 5 min, prøv et annet hjerte. Hvis ikke, analysen nye kollagenase mye gjennom kollagenase prøvetaking programmet. Pellet cellene ved sentrifugering ved 215 x g for 2 min. Pellet skal være kompakt og ikke løs. Hvis pellet er løs, inneholder preparatet mange døde celler. I en vev kultur hette, resuspend pellet i 10 mL av stoppe buffer. Pellet cellene ved sentrifugering ved 215 x g for 2 min. Pellet skal være kompakt og ikke løs. Hvis pellet er løs, inneholder preparatet mange døde celler. Resuspend cellene i 5 mL plating buffer. Utfør en celle telling. Juster milliliter av plating buffer for å nå en endelig myocyte konsentrasjon på 2 x 104 celler per ml. Fjern laminin-belagt coverslips fra inkubator. Aspirer laminin dråpe. Plate 200 μL av myocyte suspensjon på hver dekkglass. Plasser i en 37 ° c inkubator (21% O2,5% co2) for 2 h for å tillate vedlegg. Etter 2 h, aspirer de ledige cellene, tilsett 2 mL kultur Media, og kultur for opp til 4 dager. 4. fura-2 Dye lessing Lag en 2 mM fura-2 acetoxymethyl Ester (fura-2 AM) lagerløsning ved å tilsette 25 μL av DMSO til 50 mikrogram fura-2 AM pulver (1 hetteglass). Alikvot ut i 6 μL alikvoter. Ta 1 alikvot av fura-2 AM og tilsett til 6 mL plating medium. Vortex å blande. Fjern 1 6 brønn plate av myocytter fra inkubator. Aspirer medier. Tilsett 1 mL fura-2 medie blanding til hver brønn. Dekkplate med folie, la platen i romtemperatur, og vent 15 min. Aspirer fura-2 Media blanding og tilsett 1 mL Tyrode løsning til hver brønn. Dekk med folie. Vent 20 min ved romtemperatur for å tillate fargestoff bleke før bildebehandling. 5. Fluo-4 Dye lessing Lag en 1,82 mM fluo-4 acetoxymethyl Ester (fluo-4 AM) lagerløsning ved å tilsette 25 μL av DMSO til 50 mikrogram fluo-4 AM pulver (1 hetteglass). Alikvot ut i 8,333 μL alikvoter. Ta 1 alikvot av fluo-4 AM lager og tilsett til 6 mL plating medium. Vortex å blande. Fjern 1 6 brønn plate av myocytter fra inkubator. Aspirer medier. Tilsett 1 mL fluo-4 AM Media blandingen til hver brønn. Dekkplate med folie, la platen i romtemperatur, og vent 15 min. Aspirer fluo-4 AM Media blanding og tilsett 1 mL Tyrode løsning til hver brønn. Dekk med folie. Vent 20 min ved romtemperatur for å tillate fargestoff bleke før bildebehandling. 6. membran potensielle Dye lasting Fjern komponent A og komponent B fra membran potensialet Kit. I et 15 mL konisk rør, Kombiner 50 μL av komponent B og 5 μL av komponent A. Vortex å blande. Tilsett 10 mL plating Media til 15 mL konisk rør som inneholder spenningen fargestoff blanding. Vortex å blande. Fjern 1 6 brønn plate av myocytter fra inkubator. Aspirer mediene. Tilsett 800 μL av membran potensialet fargestoff blandingen til hver brønn. Dekkplate med folie, la platen i romtemperatur, og vent 15 min. Aspirer Dye Media blanding og sammenlegge 1 mL av modifisert-Tyrode ‘ løsning å hver frisk. Dekk med folie. 7. fotometri og lad sammenkoblede enhets innspillinger Slå på utstyret i følgende rekkefølge: mikroskop, lys bue lampe, hyperswitch, fluorescens grensesnitt system, Myocam strømforsyning, felt stimulator og datamaskin. Kontroller at eksitasjon/utslipps filter settene er passende for bilde fargestoffet.Merk: fura-2 er spent på 340 NM og 380 Nm lys. Det avgir på 510 NM av lys. Fluo-4 og spenningen membran fargestoff er spent på 485 NM av lys og avgir på 520 NM av lys. Prime systemet ved å slå på vakuum, helt åpne slange klemmen, og forsiktig stuper hver 60 mL sprøyte som brukes i manifold. For kalsium innspillinger bruke Tyrode ‘ s løsning. For spennings opptak bruke modifisert Tyrode ‘ s løsning. Slå på ovnen og still den inn ved å justere rulle klemmen på Lag opptak ved 36 ± 1 ° c. Åpne programvaren for oppkjøpet. Kontroller at parametrene er innstilt for riktig bilde farge. I mørket, fjerne folien fra de seks brønn plate og plassere en dekkglass i pacing kammeret. Kontroller at stimulator er slått av under dette trinnet. Fokuser på myocytter med 10x-objektiv. En gang i fokus, starte pacing etter felt stimulerende ved 1 Hz, 0,2 V. gradvis øke spenningen til 1:1 pacing er oppnådd. Deretter øker spenningen til 1.5 x terskelen er nådd.Merk: fordi eksitasjon er temperatur avhengig, sørg for at cellene har blitt perfusert i 15 minutter før opptak. Dette gjør det mulig for myocytter å komme seg fra sjokket av å gå fra romtemperatur tilbake til 37 ° c, samt løst tilknyttede celler for å flyte bort. Bytt fra 10x-målet til 40x-målet. Fokuser på en celle som følger en 1:1 tempo. Juster plast nyanser slik at bare én celle er i synsfeltet. Ved hjelp av programvaren, plassere området av interesse boksen på veldefinerte sarcomeres. Start oppkjøpet programvare for å starte eksitasjon lys. Bruk de nøytrale tetthets filtrene til å justere intensitet innstillingen tilsvarende for å få en tilstrekkelig SNR.

Representative Results

Figur 1A viser Langendorff-apparatet. Oxygenator er i KHB-HB reservoaret. Den kollagenase løsningen er i midten 60 mL sprøyte reservoar. Avgassing linjen er koblet til den tomme 60 mL sprøyte reservoaret. Etter en vellykket isolasjon, bør de fleste cellene være Rod formet og striated. Under et 40x-objektiv bør de fleste myocytter ha klare striations synlige. Figur 1B, C viser eksempler på sunne rotte myocytter. Når isolert, kan cellene bli kultivert opp til 4 dager samtidig opprettholde sin morfologi og elektriske egenskaper. For å måle eksitasjon-sammentrekning kopling, cellene blir deretter plassert i et oppvarmet pacing kammer. Fordi myocytter er følsomme for endringer i temperatur, er det viktig å la dekkglass å likevekt i 15 minutter i kammeret før innspillingen. For fluorescens innspillinger, er eksitasjon bølgelengde generert av en 75 W Xenon-Arc pære. Xenon-Arc pærer produsere et lys spektrum som etterligner naturlig sollys. Intensiteten av lyset og bølgelengden styres av nøytral tetthet/utslipps filers. Det eksitasjon lyset går deretter gjennom målet til myocyte. Utslipps bølgelengden blir deretter samlet inn av et photomultiplier rør. Ved hjelp av systemet som beskrives her, må både eksitasjon-og utslipps filtrene skiftes ut manuelt. Forkortelse på den annen side er innhentet av en ladning kombinert enhets sensor. Måle i sanntid opptil 1 000 ganger per sekund, utfører oppkjøpet programvaren et gjennomsnitt av linjene i et område av interesse for å skape en godt løst Striation mønster. En rask Fourier Transform (FFT) er så beregnet. Toppen i kraft spekteret representerer den gjennomsnittlige sarkomerlengde avstanden. Endringer i sarkomerlengde mellomrom under pacing tegnes deretter og kvantifisert deretter. Figur 2 viser kalsium og forkorte spor innspilt fra en C57/B6 mus myocyte lastet med kalsium fargestoff fura-2. Fremdrifts protokollen er en modifikasjon av Fremdrifts protokollene som er beskrevet tidligere10,11. Sunn mus myocytter skal kunne være tempoet på deres hvilepuls 10 Hz. Figur 3 er kvantifisering av ensembled gjennomsnittsdata innhentet fra en C57/B6 mus og deres TRANSGENE (TG) littermates som hadde et punkt mutasjon innført i en kalium kanal. Legg merke til det er ingen forskjell mellom gruppene unntatt for avslapning tid på 10 Hz pacing. I motsetning til fura-2 som er en dual eksitasjon fargestoff, spenningen fargestoff og fluo-4 er enkelt bølgelengde eksitasjon fargestoffer som eksitasjon/utslipp arbeid med standard FITC eksitasjon og utslipp spektrum (494/506 NM). Derfor opptak av kalsium og sarkomerlengde forkortelse eller spenning og sarkomerlengde forkortelse kan fås ved hjelp av dette filteret sett. Figur 4a viser en spennings sporing innspilt fra en C57/B6 mus Myocyte tempo ved 10 Hz. sammenlignet med kalsium signaler, er enkelt celle spennings tracings mindre i amplitude og trenger etterbehandling for å få en brukbar signal. Figur 4B viser en ensembled gjennomsnittlig handling potensial (AP) laget av APS i Figur 4A. Figur 4C, D viser en ensembled gjennomsnittlig Ap etter en lav pass Butterworth eller et Savitzky-Golay digitalt filter ble brukt. Forsiktighet må utvises når du filtrerer signalet for ikke å forvrenge den virkelige data. Legg merke til de subtile forskjellene i form av APs i Figur 4B-D. Figur 5 viser spor innspilt fra rotte myocytter tempoet ved 1 Hz. I tillegg til spennings signalet er lavere enn kalsium signalet, sammentrekning Kinetics er forskjellige også. Dette er fordi kalsium fargestoffer buffer kalsium mens spenningen fargestoffer ikke. Som med kalsium transient (Figur 3), viste myocytter tempo avhengige endringer i sin optiske handling potensiell varighet (APD) i tillegg (figur 6). Mens fura-2 sporene var ensembled gjennomsnitt før de ble kvantifisert, spenningen sporene ble filtrert med en Savitzky-Golay polynom utjevning filter (bredde 5, rekkefølge 2) før de ensembled gjennomsnitt og kvantifisert. Som kvantifisert i figur 6 og figur 7, i tillegg til å demonstrere PACING indusert endringer i APD, de også demonstrert legemiddelindusert forlengelse av Ap. Ved 4 Hz pacing, konsentrasjon avhengig blokade av forbigående utover strøm (Itil) med 4-aminopyridin resulterte i forlengelse av APD. Til slutt må det utvises forsiktighet for å unngå cytotoksisitet. Figur 8 er den siste 11 s av en 20 s innspilling. Indikeres av de røde pilene i Figur 8, forlenget eksponering av myocytter til blått lys fører til utløst aktivitet. Figur 1: konstant trykk Langendorff apparater. (A) Langendorff apparat med hver komponentmerket med hvit skrift. (B) isolert Sprague-Dawley rotte myocytter sett gjennom et 10x objektiv. (C) isolert rotte myocytter sett gjennom et 40x mål. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2: representative kalsium og sarkomerlengde forkortelse registrert fra C57/B6 myoyctes bruker fura-2. Kalsium og sarkomerlengde forkorte spor registrert på 1, 2, 4, 10, 0,5 og 0,75 Hz. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 3: kvantifisering av sarkomerlengde forkortelse, peak kalsium, avslapping tid, og reopptak tid innspilt fra en C57/B6 Wild type (WT) og transgene (TG) mus. (A) sarkomerlengde forkortelse. (B) peak kalsium. (C) avslapning tid definert som 90% tilbake til Baseline av forkorte spor. (D) reopptak tid definert som 90% tilbake til Baseline for kalsium sporet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4: optisk handling potensial registrert fra en C57/B6 mus myocyte tempo ved 10 Hz. (A) 1 sekund ikke filtrert spor. (B) Ensembled gjennomsnittlig optisk handling potensial. (C) Ensembled gjennomsnittlig optisk handling potensial etter en lavbassfilterbryter Butterworth filteret ble brukt. (D) Ensembled gjennomsnitt optisk handling potensial etter et Savitzky-Golay polynom utjevning filter ble brukt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 5: representative kalsium-, spennings-og sarkomerlengde forkortelse som er innspilt fra Sprague-Dawley rotte myocytter tempo ved 1 Hz. (A) kalsium og sarkomerlengde forkorte spor registrert på 1 Hz pacing bruke fluo-4. (B) spennings-og sarkomerlengde forkortelse som er registrert ved 1 Hz pacing ved hjelp av spennings fargestoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 6: optisk handling potensialer innspilt fra Sprague-Dawley rotte myocytter tempo på 1, 2 og 4 Hz pacing. (A) filtrert spor registrert ved 1 Hz tempo. (B) filtrert spor registrert ved 2 Hz tempo. (C) filtrert spor registrert ved 4 Hz tempo. (D) handling potensiell Varighet 10, målt som 10% tilbake til Baseline. (E) handling potensiell varighet 50, målt som 50% tilbake til Baseline. (F) handling potensiell varighet 90, målt som 90% tilbake til Baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 7: effekten av 4-aminopyridin på Sprague-Dawley rotte optisk handling potensialer registrert på 4 Hz pacing. (A) Ensembled gjennomsnitt spor registrert ved 4 Hz pacing uten 4-aminopyridin i løsningen. (B) Ensembled gjennomsnittlig spor registrert ved 4 Hz tempo med 1 μM 4-aminopyridin i løsningen. (C) Ensembled gjennomsnittlig spor registrert ved 4 Hz tempo med 10 μM 4-aminopyridin i løsningen. (D) handling potensiell Varighet 10, målt som 10% tilbake til Baseline. (E) handling potensiell varighet 50, målt som 50% tilbake til Baseline. (F) handling potensiell varighet 90, målt som 90% tilbake til Baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 8: spennings fargestoff indusert Phototoksisitet i Sprague-Dawley rotte myocytter etter 20 s av kontinuerlig lys eksponering. Røde piler angir cytotoksisk hendelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Å kunne isolere CARDIAC myocytter er en kraftig metode som kan brukes til å forstå hjerte fysiologi, patologi og toksikologiske. I protokollen ovenfor, beskrev vi en metode som utnytter en konstant gravitasjon press Langendorff apparat for å få enkelt CARDIAC myocytter. Etterpå, ved hjelp av fluorescens fotometri systemet, beskriver vi hvordan du samtidig erverve enten kalsium og forkortelse eller spenning og forkorte spor.

På grunn av de ulike Kinetics mellom kalsium fargestoffer, må forsiktighet tas på hvilke fargestoff å velge. For denne protokollen, både fura-2 og fluo-4 brukes var konstruert med AM estere nødvendiggjør en vask skritt for å tillate intracellulære esterazami tid til å holde fast i AM gruppe og felle fargestoff i cellen. Mens både fura-2 og fluo-4 anses som høy affinitet kalsium fargestoffer, er KD for fura-2 145 nM sammenlignet med 345 nM for fluo-4⁹. Videre er fura-2 ratiometrisk. På grunn av dette, kan det brukes til å kvantifisere intracellulære kalsium nivåer^9,12. Fluo-4 på den annen side er en enkelt bølge kalsium sonde. Fordelen med å bruke fluo-4 er det gir en lysere fluorescens signal. Uansett hvilke kalsium fargestoff brukes, i forhold til kalsium fargestoff, membran spennings sonder har en lavere SNR.

Som vist i Figur 4 og figur 5, spennings spor i forhold til kalsium spor er mindre i amplitude. Ved hjelp av programvaren digitale sporings filtrering, er det mulig å øke SNR og kvantifisere dataene (Figur 4 og figur 7). Når kvantifisert, både kalsium transienter og optisk APD demonstrere restitusjon, forkorte varigheten på raskere pacing frekvenser (figur 2, Figur 3, figur 6, og figur 7). Kortere APD under raskere pacing sykluser er nødvendig for å gi nok tid til ventrikkel fylling under diastolen. Endringer i dette fenomenet antas å være en indikasjon på en økning i risikoen for arrythmias^13,14,15,16. Mens endringer i APD kan være forårsaket av sykdom, kan de også være forårsaket av kjemikalier. Som vist i figur 7, når den dominerende murine repolarizing kalium strøm, jeg_til, er blokkert, den optiske APD blir lengre.

Likevel, som rapportert tidligere med spennings følsomme fargestoffer, lys intensitet og varighet kan endre APD^2,5,17. Dette antas å være et resultat av generering av reaktive oksidativt arter (ROS)⁵. Tidligere har det vært vist at tilsetning av antioksidanter til innspillingen løsningen kan hindre spennings følsomme fargestoff cytotoksisitet⁵. Som et resultat, la vi til antioksidant L-glutation (10 mM), til Tyrode ‘ s løsning. Vist i Figur 8 er de siste 11 s av en 20 s innspilling innhentet på 1 Hz pacing. Som indikert av de røde pilene, endringer i APD ikke skje før 15 s inn i opptaket; Derfor, mens den modifiserte Tyrode ‘ s løsning ikke hindre Phototoksisitet det forsinket det betydelig. Bruke modifisert Tyrode ‘ s løsning, ved hjelp av en lav lys intensitet innstilling og holde varigheten av opptaket til under 5 s, er det mulig å unngå eventuelle Dye indusert endringer i APD. Dette er viktig fordi uten å ta vare for å unngå Phototoksisitet, kan dataene bli misforstått som forårsaker tidlig eller forsinket etter depolarizations. I tillegg til å begrense eksponeringen til blått lys, er det flere forholdsregler som kan iverksettes for å forhindre feil tolkning av dataene.

Den første er å bare spille inn fra celler som følger en til en pacing og har en hvile sarkomerlengde lengde større enn eller lik 1,75 μm. 1,75 μm-grensen er tatt fra observasjon av Gordon et al.¹⁸ at spenningen raskt synker når sarkomerlengde lengde er under dette beløpet. Likevel kan visse sykdommer føre til betydelige endringer i hvile sarkomerlengde lengde. For å være sikker på at fenotype er reell og ikke en gjenstand av isolasjonen, bør følgende feilsøking tilnærminger tas.

Hvis myocytter er konsekvent ikke etter 1:1 pacing, har sarkomerlengde lengder under 1,75 μm, tung membran blebbing, eller ikke overleve isolasjonen, den første tingen å sjekke er tiden det tok å kannelerer hjertet. Jo lenger kanyleringen tid, jo lavere avkastning vil være. Hvis en lang kanyleringen tid er nødvendig, kan levedyktigheten forbedres ved å plassere hjertet i en cardioplegic løsning¹⁹. Likevel, fordi kollagenase er et enzym, aktiviteten og spesifisitet av et bestemt parti endres over tid. Hvis den samlede gir gradvis blitt verre til tross for gode kanyleringen ganger, bør nye tomter være analyseres. Mens vår protokoll ble optimalisert for 5 s innspillinger, hvis lengre spennings spor er nødvendig, vil ytterligere nøytral tetthet filtre må kjøpes. Systemet er beskrevet i protokollen kommer med nøytral tetthet filtre som reduserer overført lys med 37%, 50%, 75%, 90%, og 95%.

Oppsummert beskrev vi en metodikk som tillot isolering av voksen murine ventrikkel myocytter som ble brukt for kalsium, spenning, og sarkomerlengde forkorte målinger.

Materials

0.25 Liter Water Jacketed Reservoir	Radnoti, LLC	120142-025
1 liter volumetric flask	Fisher Scientific	10-205F
100 ml beaker	Fisher Scientific	FB-100-100
100 ml graduated cylinder	Fisher Scientific	08 562 5C
1000 ml flask	Fisher Scientific	FB-500-1000
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods	Radnoti, LLC	159951-2
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	275875
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm)	IonOptix	MSCP1-40 (b)
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip	BD	309650
Aortic Metal Cannulae	Harvard Apparatus	73-0112
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9703-100
C-6 Standard Heating Circulator	Chemyx	A30006
CaCl2	Fisher Scientific	BP510500
Cell framing adapter	IonOptix	CFA300
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12	Labratory Product Sales, Inc	V100022
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12	Labratory Product Sales, Inc	V25022
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS	Labratory Product Sales, Inc	V50022
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater	IonOptix	TEMPC2
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks	Cole-Parmer	EW-30600-23
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way	Cole-Parmer	EW-30600-12
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip	Cole-Parmer	EW-30600-01
Collagenase Type II	Worthington	LS004177
Corning Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro	IonOptix	CPUD7M
DMSO	Fisher Scientific	50980367
Dumont Tweezers Style 5	Amazon	B00F70ZDEQ
FHD Rapid Change Stimulation Chamber	IonOptix	FHDRCC1
Fluo-3/4 Optics Package	IonOptix	IonOP-Fluo
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card)	IonOptix	FSI700
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher Scientific	15-140-122
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Hemostat, Curved 5-1/2"	Amazon	B00GGAAPD0
HEPES	Fisher Scientific	BP310500
HyperSwitch dual excitation light source	IonOptix	HSW400
Inverted Motic Fluorescence Microscope	IonOptix	MSCP1-40 (a)
IonWizard Core + Analysis	IonOptix	IONWIZ
Iris Scissors, curved	Amazon	B018KRRMY6
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-100
KCl	Fisher Scientific	BP3661
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds	SouthernAnesthesiaSurgical Inc.	SP116-EA
M199 Media	Fisher Scientific	12 340 030
MgCl2	Fisher Scientific	MP021914215
MgSO4	Fisher Scientific	BP2131
MyoCam-S Digital CCD video system	IonOptix	MCS100
MyoPacer Field Stimulator	IonOptix	MYP100
NaCl	Fisher Scientific	BP358212
NaH2PO4	Fisher Scientific	56-754-9250GM
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter	Radnoti, LLC	140143-025
Photomultiplier sub-system	IonOptix	PMT400
PMT Acquisition add-on	IonOptix	PMTACQ
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap	Radnoti, LLC	158830
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir	Radnoti, LLC	120141-025
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti, LLC	120149RC
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in.	Fisher Scientific	14-171-214
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in.	Fisher Scientific	14-171-217
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in.	Fisher Scientific	14-171-219
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in.	Fisher Scientific	14-171-226
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in.	Fisher Scientific	14-171-209
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in.	Fisher Scientific	14-171-210
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in.	Fisher Scientific	14-171-213
Sarcomere Length Recording add-on	IonOptix	SARACQ
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75"	Amazon	B00JDWRBGC
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers	Amazon	B07QMZC94J
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform	IonOptix	ISO100