Optisk avbildning av isolerade murina ventrikulär myocyter

Summary

Vi presenterar metoden för isolering av murina myocyter och hur man får spänning eller kalcium spår samtidigt med sarcomere förkorta spår med fluorescensfotometri med samtidig Digital cell geometri mätningar.

Abstract

Förmågan att isolera vuxna hjärt myocyter har tillåtit forskare att studera en mängd olika hjärtsjukdomar på singelcellsnivå. Även om framstegen i kalcium känsliga färgämnen har tillåtit en robust optisk inspelning av Single cell kalciumdynamik, har inspelningen av robusta transmembranoptiska spänningssignaler varit svår. Förmodligen är detta på grund av den låga enkel-brus-förhållande, fototoxicitet, och photoblekning av traditionella potentiometriska färgämnen. Därför har enstaka cell spänningsmätningar länge varit begränsade till plåstret klämma teknik som medan Guldstandarden, är tekniskt krävande och låg genomströmning. Men med utvecklingen av nya potentiometriska färgämnen, stora, snabba optiska svar på förändringar i spänning kan erhållas med liten eller ingen fototoxicitet och photoblekning. Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar vuxna murina myocyter som kan användas för cellulära förkortning, kalcium, och optisk spänning mätningar. Specifikt, protokollet beskriver hur man använder en ratiometriska kalcium färgämne, en enda excitation kalcium färgämne, och en enda excitation spänning färgämne. Denna metod kan användas för att bedöma kardiotoxicitet och arytmogenicitet av olika kemiska ämnen. Medan fototoxicitet är fortfarande ett problem på den enda cellnivå, är metodik diskuteras om hur man minskar den.

Introduction

För att studera hjärtat under friska och patologiska tillstånd, det är ofta bra att undersöka fenotyp på enda cellnivå. Även om vetenskapliga framsteg har tillåtit robust mätning av Single cell kalciumdynamik, Single cell optisk spänning mätningar har varit knappa¹. Förmodligen är detta på grund av låg signal-brus-förhållande (SNR), fototoxicitet, och photoblekning av traditionella potentiometriska färgämnen^2,3. Icke desto mindre, isolerade myocyt optiska åtgärder potentialer har erhållits^2,3,4. Vidare, med framsteg inom kemin och fysiken i spänningskänsliga färgämnen, har SNR förbättrats⁵. Nyare membran potentiella sonder (tabell över material) reagera på förändringar i membranet potential i sub-millisekunder och har en fluorogena responsintervall på cirka 25% per 100 MV. Ytterligare, excitation/emission av membranet potentiella Kit (t. ex., FluoVolt; Tabell över material) används i detta protokoll fungerar med standard fluorescein isotiocyanat (FITC) eller grönt fluorescerande protein (GFP) inställningar⁶.

FITC och GFP excitation/emission Spectra överlappar fluo-4 kalcium bundet Spectra⁷. Samtidig anskaffning av fluorescensfotometri med mätningar av digital cell geometri har traditionellt använts för samtidig anskaffning av kalcium-och cellulära förkortningsmätningar⁸. Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar murina myocyter och hur man spelar in kalcium eller spänningssignaler med hjälp av standard FITC inställningar. Dessutom beskriver det hur en enkel switch i excitation/utsläpp filter på Imaging Workstation kan användas för att få kalcium och förkorta mätningar med hjälp av förhållandet metriska kalcium färgämne fura-2. Jämfört med fluo-4 har fura-2 en högre affinitet för kalcium och är relativt motståndskraftig mot foto blekning⁹. Därför, med hjälp av en enda arbetsstation detta protokoll möjliggör en grundlig undersökning av enstaka myocyt excitation-kontraktion koppling.

Protocol

Alla metoder och förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Case Western Reserve University. 1. beredning av lösningar, instrument och täckglas Obs: 1x lösningar kan användas i upp till en månad. Göra 10X Krebs-Henseleit buffert HEPES buffert utan kalcium (KHB-HB) vid tillägger 68,96 g av NaCl, 3,57 g av KCl, 59,58 g av HEPES, 2,18 g av K2HPO4, 3,08 g av mgso4 och 19,82 g av glukos till 800 ml av dubbel destillerat vatten i en 1 000 ml kolv. När innehållet är helt upplöst, ta upp till volym i en 1 000 mL mätkolv.Anmärkning: traditionell Krebs Henseleit lösning använder natriumbikarbonat som buffert och lösningen i detta protokoll använder Krebs Henseleit lösning med HEPES buffert. Lösningen är stabil i 6 månader om steril filtreras. Gör 10X Tyrodes lösning genom att tillsätta 86,51 g NaCl, 0,552 g NaH2Po4, 2,03 g av mgcl2, 9,91 g glukos, 4,03 g KCL, 2,65 g av CaCl2, och 35,76 g av Hepes till 800 ml dubbeldestillerat vatten i en 1000 ml kolv. När innehållet är helt upplöst, ta upp till volym i en 1000 mL mätkolv.Obs: lösningen är stabil i 6 månader om steril filtreras. Gör 1x KHB-HB genom att mäta ut 100 mL av 10X beståndet och lägga till 875 mL dubbelt destillerat vatten i en 1 000 mL kolv. Placera kolven i 37 ° c vattenbad. När lösningen har nått 37 ° c, Använd NaOH för att öka pH till 7,39. Efter justering av pH, ta lösning till volym i en 1000 mL mätkolv. Sterilt filter lösningen med hjälp av ett vakuum filtreringssystem. Gör 1x Tyrodes lösning genom att mäta ut 100 mL av 10X-stocken och tillsätt 875 mL dubbelt destillerat vatten i en 1 000 mL kolv. Placera kolven i 37 ° c vattenbad. När lösningen har nått 37 ° c, Använd NaOH för att öka pH till 7,39. Efter justering av pH, ta lösning till volym i en 1 000 mL mätkolv. Sterilt filter med hjälp av ett vakuum filtreringssystem. Gör 1x modifierad Tyrodes lösning genom att mäta ut 100 mL av 10X-stocken och lägga till 875 mL dubbelt destillerat vatten i en 1 000 mL kolv. Lös 3,07 g L-Glutathione reducerad i kolv. Placera kolven i 37 ° c vattenbad. När lösningen har nått 37 ° c, Använd NaOH för att öka pH till 7,39. Efter justering av pH, ta lösning till volym i en 1 000 mL mätkolv. Sterilt filter lösningen med hjälp av ett vakuum filtreringssystem. Gör 100 mM blebbistatin stamlösning genom att tillsätta 855 μL dimetylsulfoxid (DMSO) till 25 mg pulver. I steg om 20 μL och förvara i en-80 ° c frys i upp till sex månader. Gör stoppbuffert genom att tillsätta 2 g bovint serumalbumin (BSA) och 1 injektionsflaska med aliciterat blebbistatin-lager till 100 mL 1x KHB-HB och sterilt filter lösningen med ett vakuum filtreringssystem. Gör plätering buffert genom att tillsätta 5 mL av fetalt Nötkreaturserum och 1 injektionsflaska av den aliciterade blebbistatin lager till 95 mL av M199 HEPES. Sterilt filter lösningen med hjälp av ett vakuum filtreringssystem. Gör myocyt kulturbuffert genom att tillsätta en 1 injektionsflaska av aliciterat blebbistatin lager och 4 MLS penicillin-streptomycin till 396 ml av M199 (25 mm Heper). Sterilt filter lösningen med hjälp av ett vakuum filtreringssystem. Autoklav 2 par Dumont pincett, 2 par Iris böjda sax, 2 hemostats, ett par plastikkirurgi forceps, 6 svart flätad siden 4-0 suturer arrangeras för att användas som en kirurgisk dubbel-kasta Knut, och 4 100 mL bägare. Sterilisera 22 x 22 mm2 glas täckband. Först, placera en enda täckslip i varje brunn av en sex väl tallrik. Efteråt, med locket avlägsnad, slå på UV-lampan på biosäkerhets skåpet och exponera täckglas till UV-ljus för 1 h. Gör bearbetning laminin lagerlösning genom att först upptinning flaskan på isen. Tillsätt innehållet i en flaska till tillräckligt kallt steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att nå en slutlig koncentration på 0,04 mg/mL. Alikvot ut 1,3 μL i autoklaverade 1,5 mL centrifugrör. Förvaras vid-80 ° c.Anmärkning: varje tub har tillräckligt med laminin för en enda sex brunn plattan. Undvik flera frys tining cykler. Coat steriliserad täckslip genom att först upptinning den arbetande laminin lösning på is. Använd en P1000 pipett och aspirera 200 μL laminin. Dra försiktigt pipettspetsen längs ena kanten av täckglasen för att tillåta kapillärverkan att dra ut en mycket liten mängd laminin för att underlätta täckglasinfästning till de sex brunn plattan. Sedan, utvisa återstående laminin i mitten av täckglassen. I en cirkelrörelse, sprida laminin dropp över täckglasets. Placera i en inkubator på 37 ° c minst 1 h och upp till 24 h före isoleringen. 2. beredning av Langendorffs apparat Anmärkning: de enskilda komponenterna i Langendorff-apparaten som används i detta protokoll anges i tabell över material. Slå på det cirkulerande vattenbadet. Ställ in temperaturen så att parfymen har en temperatur på 37 ° c.Anmärkning: med lösningen reservoarer inställd på en höjd av 60 cm, den cirkulerande vattenfödsel måste ställas in på 41 ° c för att ha vätska vara 37 ° c. Till skillnad från tidigare rapporterade protokoll behöver reservoarens höjd inte ändras. Skölj Langendorff-apparaten med 70% etanol följt av två sköljning med autoklaverat dubbeldestillerat vatten. Efter sköljning, Fyll reservoaren med Khb-HB och syresätta med 100% syre. Prime systemet genom att låta syresatt Khb-HB till första flödet till en 100 ml bägare. När 50 mL lösning har flödat in i bägaren, växla 3-vägs stopp-Cock position för att stoppa flödet från KHB-HB reservoaren. Häll 50 mL syrat KHB-HB från bägaren i kollagenasreservoaren. Låt KHB-HB rinna från rötnings behållaren tills 5 mL finns kvar i kollagenasreservoaren. Medan priming kollagenas från Reservoir, växla 3-vägs stopp kuk upprepade gånger mellan reservoarer för att tillåta linjer att Degas. När systemet är primade, kom ihåg att använda avgasning fällan ligger ovanpå värme spolen så att eventuella kvarvarande luft att lämna systemet. Gör kollagenase lösningen. För råttor kombinera 100 mg av typ II kollagenas, 100 ml syresatt Khb-HB, och 2 injektionsflaskor av blebbistain beståndet. För möss, kombinera 100 mg av typ II kollagenas, 40 ml syresatt Khb-HB, och 2 injektionsflaskor av blebbistain beståndet. En gång blandad, lösningen bör vara stabil för 1 h.Obs: myocyte lönsamhet kan variera mellan typ II kollagenase partier. Dra nytta av en kollagenase provtagningsprogram för att testa en hel del innan bulk beställning. 3. myocyte isolering Injicera djuret med 1 000 U heparin. Vänta 5 min.Obs: möss och råttor i alla åldrar kan användas. Men i allmänhet den äldre eller mer sjuka djuret, desto lägre myocyt avkastning. Offra djuret genom att först anesthetizing det med isofluran med hjälp av Open-Drop metoden (1 cc av isofluran per 500 cc volym) innan euthanizing djuret med en pentobarbital blandning (150 mg/kg intraperitoneal). Snabbt punktskatter hjärtat genom att först gripa tag i pälsen ovanför xiphoid processen. Med Iris sax, göra ett litet snitt omedelbart under xiphoid processen och dra pälsen uppåt mot huvudet utsätta huden. Greppa xiphoid processen och skär membranet utsätta bröstkorg hålighet. Gör en fälla dörr snitt, dra bröstbenet tillbaka med hjälp av en hemostat, och använda böjda tången till punktskatter hjärtat ovanför stigande aorta och plats i kallt KHB-HB. Kanylera hjärtat med hjälp av ett stereomikroskop och nummer 5 tång. Se till att hjärtat är nedsänkt och kanyl var primas innan hjärtat excision för att förhindra emboli. Bekräfta korrekt positionering av kanyl genom att visualisera spetsen av kanyl ca 1 mm ovanför aorta införing i ventrikeln.Obs: ju snabbare kanylering tid, desto bättre myocyt avkastning. Starta flödet av Khb-HB genom att vrida Avstängningskranen på langendorff. Anslut kanylen till Langendorff. Parfymera hjärtat i 5 min.Obs: eftersom perfusion tillhandahålls av en gravitation-baserade system, flöde genom hjärtat kommer att vara en funktion av kranskärlssjukdom efterlevnad. Växla perfusion från KHB-HB reservoaren till digestionsbufferten reservoaren. När digestionsbufferten når hjärtat, ställa in en timer (5 min för mus eller 15 min för råtta). Se till att samla upp parfymen i en steril 100 mL bägare. Fyll på behållaren för uppslutning vid behov med parfymen tills digestionstiden har löpt ut. Efter matsmältningen, separera kamrarna i hjärtat med tång och Iris saxen i en steril 100 mL bägare. Placera varje kammare i en separat brunn av en sex brunn pläterar. Häll 5 mL kollagenaslösning i varje brunn. Omedelbart börja malning hjärtvävnad med hjälp av sax. Vävnad bitar bör vara cirka 1 mm3. Använd sterila överföringpipetter och försiktigt triturera den malda hjärt vävnaden. Lösningen ska bli grumlig. När vävnaden bitar blir vita och fjäderlätt, undersöka cellerna med ett inverterat Mikroskop. Om antalet livskraftiga celler är större än 80%, Fortsätt att anstränga cellerna i ett 50 mL koniskt rör med en 100 μm cell SIL. Använd en annan slang och sil för varje kammare i hjärtat. Om antalet livskraftiga celler är mindre än 80%, kontrollera den tid det tog att kannulat. Om kanyleringstiden är över 5 min, prova ett annat hjärta. Om inte, assay nya kollagenase partier genom kollagenase provtagnings programmet. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 215 x g för 2 min. Pelleten ska vara kompakt och inte lös. Om pelleten är lös, innehåller preparatet många döda celler. I en vävnad kultur huva, Omsuspendera pelleten i 10 mL av stoppbufferten. Pelleten cellerna genom centrifugering vid 215 x g för 2 min. Pelleten ska vara kompakt och inte lös. Om pelleten är lös, innehåller preparatet många döda celler. Omsuspendera cellerna i 5 mL pläteringsbuffert. Utför ett cellantal. Justera milliliter av pläteringsbuffert för att nå en slutlig myocyt koncentration av 2 x 104 celler per ml. Ta bort laminin-belagda täckglas från inkubatorn. Aspirera laminin droplet. Platta 200 μl av myocyt suspension på varje täckslip. Placera i en inkubator på 37 ° c (21% O2,5% Co2) för 2 h för att medge kvarstad. Efter 2 h, aspirera de okopplade cellerna, tillsätt 2 mL kulturmedia och kultur i upp till 4 dagar. 4. fura-2 färgämne lastning Gör en 2 mM fura-2 acetoxymethyl Ester (fura-2 AM) stamlösning genom att tillsätta 25 μL av DMSO till 50 μg fura-2 AM pulver (1 injektionsflaska). Alikvot ut i 6 μL alikvoter. Ta 1 alikvot av fura-2 AM och tillsätt till 6 mL pläteringsmedium. Virvel för att blanda. Ta bort 1 6 brunn plattan av myocyter från inkubatorn. Aspirate media. Tillsätt 1 mL fura-2-medieblandning till varje brunn. Täckplåt med folie, lämna plattan i rumstemperatur, och vänta 15 min. Aspirera fura-2 Media blandning och tillsätt 1 mL Tyrodes lösning till varje brunn. Täck med folie. Vänta 20 min vid rumstemperatur för att möjliggöra färg bortspolat före avbildning. 5. laddning av fluo-4-färg Gör en 1,82 mM fluo-4 acetoxymethyl Ester (fluo-4 AM) stamlösning genom att tillsätta 25 μL av DMSO till 50 μg fluo-4 AM pulver (1 injektionsflaska). Alikvot ut i 8,333 μL alikvoter. Ta 1 alikvot av fluo-4 AM lager och tillsätt till 6 mL plätering medium. Virvel för att blanda. Ta bort 1 6 brunn plattan av myocyter från inkubatorn. Aspirate media. Tillsätt 1 mL fluo-4 AM-medieblandning i varje brunn. Täckplåt med folie, lämna plattan i rumstemperatur, och vänta 15 min. Aspirera fluo-4 AM Media blandning och tillsätt 1 mL Tyrodes lösning till varje brunn. Täck med folie. Vänta 20 min vid rumstemperatur för att möjliggöra färg bortspolat före avbildning. 6. membran potentiell färgning lastning Ta bort komponent A och komponent B från membran potentialsatsen. I ett 15 mL koniskt rör, kombinera 50 μL av komponent B och 5 μL av komponent A. Vortex för att blanda. Tillsätt 10 mL bordsmedia till 15 mL koniskt rör som innehåller blandningen av spännings färgämne. Virvel för att blanda. Ta bort 1 6 brunn plattan av myocyter från inkubatorn. Aspirera medierna. Tillsätt 800 μL av membranet potentiell färgblandning till varje brunn. Täckplåt med folie, lämna plattan i rumstemperatur, och vänta 15 min. Aspirate Dye Media blandning och tillsätt 1 mL modifierad Tyrodes lösning till varje brunn. Täck med folie. 7. fotometri och laddning av kopplade enhets inspelningar Slå på utrustningen i följande ordning: Mikroskop, båg lampa, hyperswitch, fluorescensgränssnitt system, Myocam strömförsörjning, fältstimulator, och dator. Se till att excitation/utsläpp filteruppsättningar är lämpliga för Imaging Dye.Obs: fura-2 är upphetsad vid 340 nm och 380 Nm av ljus. Den avger vid 510 nm av ljus. Fluo-4 och spännings membran färg är upphetsad vid 485 nm av ljus och avger vid 520 Nm av ljus. Prime systemet genom att vrida på vakuum, helt öppna slangklämman, och försiktigt störta varje 60 mL spruta som används i grenröret. För kalcium inspelningar används Tyrodes lösning. För spännings inspelningar används modifierad Tyrodes lösning. Slå på aggregatet och Ställ in flödet genom att justera rullklämman på per fusions slangen. Gör inspelningar vid 36 ± 1 ° c. Öppna anskaffningsprogram varan. Kontrollera att parametrarna är inställda för rätt bild färg. I mörkret, ta bort folien från de sex väl plattan och placera en täckslip i pacing kammaren. Se till att stimulatorn är avstängd under detta steg. Fokusera på myocyterna med hjälp av 10X mål. När i fokus, börja pacing av fält stimulerande vid 1 Hz, 0,2 V. gradvis öka spänningen tills 1:1 pacing erhålls. Öka sedan spänningen tills 1.5 x tröskeln är nådd.Anmärkning: eftersom excitation-kontraktion koppling är temperaturberoende, se till att cellerna har varit parfymera för 15 min före inspelningen. Detta gör det möjligt för myocyter att återhämta sig från chocken att gå från rumstemperatur tillbaka till 37 ° c samt löst anslutna celler att flyta bort. Växla från 10X mål till 40x mål. Fokusera på en cell som följer en 1:1 pacing. Justera plast nyanser så att bara en cell är inom synfältet. Använda programvaran, placera området intresse rutan på väldefinierade sarkomeres. Starta förvärvet programvara för att initiera excitation ljus. Med hjälp av neutral densitet filter, justera intensiteten inställningen för att få en adekvat SNR.

Representative Results

Figur 1A visar langendorffs apparat. Oxygenatoren är i den KHB-HB behållaren. Kollagenaslösningen är i mitten 60 mL spruta reservoar. Den avgasning linjen är ansluten till den tomma 60 mL spruta reservoaren. Efter en lyckad isolering, bör de flesta av cellerna vara stavformade och tvärstrimmig. Under en 40x mål, de flesta myocyter bör ha tydliga striationer synlig. Figur 1B, C visar exempel på friska råtta myocyter. När isolerade, celler kan odlas upp till 4 dagar samtidigt bibehålla sin morfologi och elektriska egenskaper. För att mäta excitation-kontraktion koppling, cellerna placeras sedan i en uppvärmd pacing kammare. Eftersom myocyter är känsliga för förändringar i temperatur, är det viktigt att låta täckslip att jämvikt för 15 min i kammaren innan inspelningen. För fluorescensinspelningar genereras magnetiseringen våglängd av en 75 W Xenon-Arc glödlampa. Xenon-Arc-glödlampor ger ett ljusspektrum som härmar naturligt solljus. Intensiteten av ljuset och våglängd styrs av neutral densitet/utsläpp filers. Excitationsljuset passerar sedan genom målet till myocyten. Utsläpps våglängden samlas därefter in av ett photomultiplierrör. Med hjälp av det system som beskrivs här måste både excitation-och emissions filtren bytas manuellt. Förkortning å andra sidan erhålls genom en laddning kopplad enhets sensor. Mätning i realtid upp till 1 000 gånger per sekund, utför förvärvet programvara ett genomsnitt av de linjer inom ett område av intresse för att skapa en väl löst strimmor mönster. En snabb Fouriertransform (FFT) beräknas sedan. Toppen inom Power Spectrum representerar den genomsnittliga sarcomere avstånd. Förändringar i sarcomere avstånd under pacing sedan ritas och därefter kvantifieras. Figur 2 visar kalcium och förkorta spår inspelade från en C57/B6 mus myocyt laddad med kalcium färgämnet fura-2. Pacing-protokollet är en modifiering av pacing-protokollen som beskrevs tidigare10,11. Friska mus myocyter bör kunna vara tempo på sin vilopuls 10 Hz. figur 3 är kvantifiering av genomsnittliga data som erhållits från en C57/B6 möss och deras TRANSGENA (TG) littermates som hade en punktmutation infördes i en kalium kanal. Observera att det inte finns någon skillnad mellan grupperna förutom avkopplings tiden vid 10 Hz pacing. Till skillnad från fura-2 som är en dubbel excitation färgämne, är spänningen färgämne och fluo-4 enda våglängd excitation färgämnen vars excitation/utsläpp arbete med standard FITC excitation och utsläpp spektrum (494/506 nm). Därför kan inspelningar av kalcium och sarcomere förkortning eller spänning och sarcomere förkortning erhållas med hjälp av denna filteruppsättning. Figur 4a visar en spännings spårning inspelad från en C57/B6 mus myocyt tempo vid 10 Hz. jämfört med kalcium signaler, enda cell spännings tracings är mindre i amplitud och behöver efter bearbetning för att få en användbar signal. Figur 4B visar en grupperad genomsnittlig actionpotential (AP) som gjorts från APS i figur 4A. Figur 4C, D visar en ENSEMBLEN genomsnittlig AP efter en låg passera Butterworth eller Savitzky-GOLAY Digital filter tillämpades. Försiktighet måste iakttas vid filtrering av signalen för att inte förvränga verkliga data. Lägg märke till de subtila skillnaderna i form av APs i figur 4B-D. Figur 5 visar spår inspelade från råtta myocyter tempo vid 1 Hz. Förutom att spänningen signalen är lägre än kalcium signalen, kontraktion kinetik är olika också. Detta beror på att kalcium färgämnen buffert kalcium medan spännings färger inte. Som med kalcium övergående (figur 3), myocyter visat pacing beroende förändringar i deras optiska åtgärder potentiella duration (APD) samt (figur 6). Medan fura-2 spår var ensemblen i genomsnitt innan de kvantifierades, var spänningen spår filtreras med en Savitzky-GOLAY polynom utjämning filter (bredd 5, ordning 2) innan ensemblen genomsnitt och kvantifieras. Som kvantifierats i figur 6 och figur 7, förutom att demonstrera pacing INDUCERADE förändringar i APD, de visade också LÄKEMEDELSINDUCERAD förlängning av AP. Vid 4 Hz pacing, koncentrationsberoende blockad av den övergående yttre strömmen (Itill) med 4-aminopyridin resulterade i förlängning av APD. Slutligen, försiktighet måste iakttas för att undvika cytotoxicitet. Figur 8 är den sista 11 s av en 20 s inspelning. Indikeras av de röda pilarna i figur 8, långvarig exponering av myocyter till blått ljus leder till utlöst aktivitet. Figur 1: Langendorff-apparat med konstant tryck. ALangendorff-apparaten med varje komponent märkt med vitt bokstäver. (B) isolerade Sprague-Dawley råtta myocyter ses genom en 10X mål. (C) isolerade råtta myocyter ses genom en 40x mål. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: representativ kalcium och sarcomere förkortning spår inspelade från C57/B6 myoyctes med fura-2. Kalcium och sarcomere förkorta spår registreras på 1, 2, 4, 10, 0,5 och 0,75 Hz. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: kvantifiering av sarcomere förkortning, Peak calcium, avkopplingstid och återupptagnings tid inspelad från en C57/B6 Wild typ (WT) och transgena (TG) möss. Asarcomere förkortning. Bhögsta kalcium. (C) avkopplingstid definierad som 90% återgång till baslinjen av förkortnings spårningen. Dåterupptagnings tid definierad som 90% återgång till baslinjen av kalcium spårningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: optisk actionpotential inspelad från en C57/B6 mus myocyt tempo vid 10 Hz. A) 1 andra ofiltrerade spår. (B) ensemblen i genomsnitt optisk åtgärd potential. (C) ensemblen i genomsnitt optiska åtgärder potential efter en låg pass Butterworth filter tillämpades. (D) den genomsnittliga optiska actionpotentialen i ensemblen efter en Savitzky-GOLAY polynom utjämnande filter tillämpades. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: representativ kalcium, spänning, och sarcomere förkorta spår inspelade från Sprague-Dawley råtta myocyter tempo på 1 Hz. A) kalcium-och sarkomereförkortande spårsomregistrerats vid 1 Hz pacing med fluo-4. (B) spänning och sarcomere förkorta spår registreras vid 1 Hz pacing med hjälp av spännings färgämne. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 6: optiska actionpotentialer inspelade från Sprague-Dawley råtta myocyter tempo på 1, 2, och 4 Hz pacing. (A) filtrerat spår inspelat vid 1 Hz pacing. (B) filtrerat spår inspelat vid 2 Hz pacing. C) filtrerat spår som spelats in vid 4 Hz pacing. (D) åtgärd potentiell varaktighet 10, mätt som 10% återgång till baslinjen. Ehandlings potentialduration 50, mätt som 50% återgång till baslinjen. Fhandlings potentialduration 90, mätt som 90% återgång till baslinjen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 7: effekterna av 4-aminopyridin på Sprague-Dawley råtta optiska åtgärder potentialer registreras vid 4 Hz pacing. A) ensembleni genomsnitt spår som registrerats vid 4 Hz pacing utan 4-aminopyridin i lösningen. (B) ensemblen genomsnittlig spår som registrerats vid 4 Hz pacing med 1 μm 4-aminopyridin i lösningen. (C) ensemblen i genomsnitt spår inspelad vid 4 Hz pacing med 10 μm 4-aminopyridin i lösningen. (D) åtgärd potentiell varaktighet 10, mätt som 10% återgång till baslinjen. Ehandlings potentialduration 50, mätt som 50% återgång till baslinjen. Fhandlings potentialduration 90, mätt som 90% återgång till baslinjen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 8: spänning Dye inducerad fototoxicitet i Sprague-Dawley råtta myocyter efter 20 s av kontinuerlig ljus exponering. Röda pilar indikerar cytotoxiska händelser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Att kunna isolera hjärt myocyter är en kraftfull metod som kan användas för att förstå hjärtfysiologi, patologi, och toxikologi. I ovanstående protokoll, vi beskrev en metod som utnyttjar en konstant gravitation tryck Langendorff apparat för att få enda hjärt myocyter. Efteråt, med hjälp av fluorescensfotometri systemet, beskriver vi hur man samtidigt förvärvar antingen kalcium och förkortning eller spänning och förkorta spår.

På grund av den olika kinetik mellan kalcium färgämnen, måste försiktighet iakttas på vilken färg att välja. För detta protokoll, både fura-2 och fluo-4 som används var konstruerade med AM estrar som kräver ett tvättsteg för att möjliggöra intracellulära esteraser tid att klyva AM-gruppen och fälla färgen i cellen. Medan både fura-2 och fluo-4 anses vara hög affinitet kalcium färgämnen, är KD för fura-2 145 nM jämfört med 345 nM för fluo-4⁹. Vidare är fura-2 ratiometriskt. På grund av detta, det kan användas för att kvantifiera intracellulära kalciumnivåer^9,12. Fluo-4 å andra sidan är en enda våg kalcium sond. Fördelen med att använda fluo-4 är att den ger en ljusare fluorescens-signal. Oavsett vilket kalcium färgämne används, jämfört med kalcium färgämnet, membran spänning sonder har en lägre SNR.

Som framgår av figur 4 och figur 5, är spännings spår jämfört med kalcium spår mindre i amplitud. Med hjälp av programvarans digitala spår filtrering, är det möjligt att öka SNR och kvantifiera data (figur 4 och figur 7). En gång kvantifierat, både kalcium transienter och optiska APDs Visa restitution, förkorta deras varaktighet vid snabbare pacing frekvenser (figur 2, figur 3, figur 6, och figur 7). Kortare APDs under snabbare pacing cykler är nödvändiga för att ge tillräckligt med tid för ventrikulär fyllning under diastole. Förändringar i detta fenomen tros vara ett tecken på en ökning av risken för arytmier^13,14,15,16. Medan förändringar i APD kan orsakas av sjukdom, de kan också orsakas av kemikalier. Som visas i figur 7, när den dominerande murina repolariserande kalium ström, i_till, blockeras, den optiska APD blir längre.

Fortfarande, som rapporterats tidigare med spänningskänsliga färgämnen, ljusstyrka och varaktighet kan förändra APD^2,5,17. Detta tros vara resultatet av generering av reaktiva oxidativa arter (ROS)⁵. Tidigare har det visats att tillsats av antioxidanter till inspelnings lösningen kan förhindra spänningskänsliga Dye cytotoxicitet⁵. Som ett resultat, vi lagt till antioxidanten L-Glutathione (10 mM), till Tyrodes lösning. Visas i figur 8 är de sista 11 s av en 20 s inspelning erhålls vid 1 Hz pacing. Som indikeras av de röda pilarna, förändringar i APD inträffade inte förrän 15 s i inspelningen; Därför, medan den modifierade Tyrodes lösning inte hindrade fototoxicitet det fördröjde det signifikant. Med hjälp av modifierad Tyrodes lösning, med en låg ljusintensitet inställning och hålla varaktigheten av inspelningen till under 5 s, är det möjligt att undvika eventuella Dye inducerade förändringar i APD. Detta är viktigt eftersom utan att vara noga med att undvika fototoxicitet, data kan misstolkas som orsakar tidig eller fördröjd efter depolarizations. Förutom att begränsa exponeringen för blått ljus, finns det ytterligare försiktighetsåtgärder som kan vidtas för att förhindra feltolkning av data.

Den första är att endast spela in från celler som följer en till en pacing och har en vilande sarcomere längd större än eller lika med 1,75 μm. Den 1,75 μm cutoff tas från observation av Gordon et al.¹⁸ att spänningen snabbt avtar när sarcomere längd är under detta belopp. Icke desto mindre, vissa patologier kan resultera i betydande förändringar i vilande sarcomere längd. För att vara säker på att fenotypen är verklig och inte en artefakt av isoleringen, bör följande problem tagnings metoder tas.

Om myocyter är genomgående inte följer 1:1 pacing, har sarcomere längder under 1,75 μm, tungt membran blebbing, eller inte överlever isoleringen, det första att kontrollera är den tid det tog att kannulate hjärtat. Ju längre kanylering tid, desto lägre avkastningen blir. Om en lång kanylering tid krävs, kan lönsamheten förbättras genom att placera hjärtat i en cardioplegic lösning¹⁹. Icke desto mindre, eftersom kollagenase är ett enzym, aktivitet och specificitet av ett visst parti förändras över tiden. Om den totala avkastningen successivt förvärras trots god kanylering gånger, nya partier bör analyseras. Medan vårt protokoll var optimerat för 5 s inspelningar, om längre spännings spår behövs, kommer ytterligare neutrala täthetsfilter att behöva köpas. Systemet som beskrivs i protokollet levereras med neutrala täthetsfilter som minskar det överförda ljuset med 37%, 50%, 75%, 90% och 95%.

Sammanfattnings, beskrev vi en metod som tillät isolering av vuxna murina ventrikulära myocyter som användes för kalcium, spänning, och sarcomere förkorta mätningar.

Materials

0.25 Liter Water Jacketed Reservoir	Radnoti, LLC	120142-025
1 liter volumetric flask	Fisher Scientific	10-205F
100 ml beaker	Fisher Scientific	FB-100-100
100 ml graduated cylinder	Fisher Scientific	08 562 5C
1000 ml flask	Fisher Scientific	FB-500-1000
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods	Radnoti, LLC	159951-2
4-Aminopyridine	Sigma-Aldrich	275875
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm)	IonOptix	MSCP1-40 (b)
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip	BD	309650
Aortic Metal Cannulae	Harvard Apparatus	73-0112
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP9703-100
C-6 Standard Heating Circulator	Chemyx	A30006
CaCl2	Fisher Scientific	BP510500
Cell framing adapter	IonOptix	CFA300
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12	Labratory Product Sales, Inc	V100022
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12	Labratory Product Sales, Inc	V25022
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS	Labratory Product Sales, Inc	V50022
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater	IonOptix	TEMPC2
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks	Cole-Parmer	EW-30600-23
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way	Cole-Parmer	EW-30600-12
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip	Cole-Parmer	EW-30600-01
Collagenase Type II	Worthington	LS004177
Corning Sterile Cell Strainers	Fisher Scientific	07-201-432
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro	IonOptix	CPUD7M
DMSO	Fisher Scientific	50980367
Dumont Tweezers Style 5	Amazon	B00F70ZDEQ
FHD Rapid Change Stimulation Chamber	IonOptix	FHDRCC1
Fluo-3/4 Optics Package	IonOptix	IonOP-Fluo
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card)	IonOptix	FSI700
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher Scientific	15-140-122
Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Hemostat, Curved 5-1/2"	Amazon	B00GGAAPD0
HEPES	Fisher Scientific	BP310500
HyperSwitch dual excitation light source	IonOptix	HSW400
Inverted Motic Fluorescence Microscope	IonOptix	MSCP1-40 (a)
IonWizard Core + Analysis	IonOptix	IONWIZ
Iris Scissors, curved	Amazon	B018KRRMY6
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-100
KCl	Fisher Scientific	BP3661
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds	SouthernAnesthesiaSurgical Inc.	SP116-EA
M199 Media	Fisher Scientific	12 340 030
MgCl2	Fisher Scientific	MP021914215
MgSO4	Fisher Scientific	BP2131
MyoCam-S Digital CCD video system	IonOptix	MCS100
MyoPacer Field Stimulator	IonOptix	MYP100
NaCl	Fisher Scientific	BP358212
NaH2PO4	Fisher Scientific	56-754-9250GM
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter	Radnoti, LLC	140143-025
Photomultiplier sub-system	IonOptix	PMT400
PMT Acquisition add-on	IonOptix	PMTACQ
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap	Radnoti, LLC	158830
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir	Radnoti, LLC	120141-025
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber	Radnoti, LLC	120149RC
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in.	Fisher Scientific	14-171-214
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in.	Fisher Scientific	14-171-217
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in.	Fisher Scientific	14-171-219
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in.	Fisher Scientific	14-171-226
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in.	Fisher Scientific	14-171-209
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in.	Fisher Scientific	14-171-210
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in.	Fisher Scientific	14-171-213
Sarcomere Length Recording add-on	IonOptix	SARACQ
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75"	Amazon	B00JDWRBGC
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers	Amazon	B07QMZC94J
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform	IonOptix	ISO100