Etablierung von Single-Cell-basierten Kokulturen auf deterministischem Weg mit einem mikrofluidischen Chip
Summary
Dieser Bericht beschreibt eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zum Einrichten eines Einzelzellkulturexperiments, bei dem eine hocheffiziente Kopplung und mikroskopische Analyse mehrerer Einzelzellen erreicht werden kann.
Abstract
Zell-Co-Kultur-Assays wurden häufig für die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen verwendet, um die Biologie von Krankheiten einschließlich Krebs besser zu verstehen. Es ist jedoch schwierig, den komplexen Mechanismus interzellulärer Wechselwirkungen in hochheterogenen Zellpopulationen mithilfe konventioneller Kokultursysteme zu klären, da die Heterogenität der Zellsubpopulation durch die Durchschnittswerte verdeckt wird; die herkömmlichen Co-Kultur-Systeme können nur verwendet werden, um das Populationssignal zu beschreiben, sind aber nicht in der Lage, das Verhalten einzelner Zellen zu verfolgen. Darüber hinaus haben herkömmliche einzellige experimentelle Methoden aufgrund der Poisson-Verteilung eine geringe Effizienz bei der Zellmanipulation. Mikrogefertigte Geräte sind eine neue Technologie für Einzelzellstudien, da sie einzelne Zellen mit hohem Durchsatz genau manipulieren und den Proben- und Reagenzverbrauch reduzieren können. Hier beschreiben wir das Konzept und die Anwendung eines mikrofluidischen Chips für mehrere einzellige Kokulturen. Der Chip kann effizient mehrere Arten von Einzelzellen in einer Kulturkammer erfassen (ca. 46%) und verfügt über einen ausreichenden Kulturraum, der nützlich ist, um das Verhalten der Zellen (z. B. Migration, Proliferation usw.) unter Zell-Zell-Interaktion auf einzelzeller Ebene zu untersuchen. Lymphatische Endothelzellen und orales Plattenepithelkarzinom wurden verwendet, um ein einzelliges Kokulturexperiment auf der mikrofluidischen Plattform für live multiple Einzelzell-Interaktionsstudien durchzuführen.
Introduction
Effiziente Erfassung verschiedener Typen von Einzelzellen und Bereitstellung von ausreichend Kulturraum sind für Einzelzell-Kokulturexperimente mehrerer Typen von Einzelzellenerforderlich 1. Die Begrenzung der Verdünnung ist aufgrund der geringen Kosten der erforderlichen Ausrüstung die am häufigsten verwendete Methode, um die einzelnen Zellen auf solche Experimente vorzubereiten. Aufgrund der Poisson-Verteilungsbeschränkung beträgt die maximale Einzelzellerfassungswahrscheinlichkeit jedoch nur 37 %, was die experimentelle Operation mühsam und zeitaufwändig macht2. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) die Poisson-Verteilungsbeschränkung überwinden, um hocheffiziente Einzelzellen vorzubereiten3. FACS ist jedoch aufgrund teurer Instrumentierungs- und Wartungskosten für einige Laboratorien möglicherweise nicht zugänglich. Mikrofabrizierte Geräte wurden vor kurzem für Einzelzellen-Trapping4,Einzelzellen-Kopplung5und Einzelzellen-Kulturanwendungen entwickelt. Diese Geräte sind vorteilhaft aufgrund ihrer Fähigkeit, einzelne Zellen genau zu manipulieren6, durchführen Hochdurchsatzexperimente, oder reduzieren Proben- und Reagenzverbrauch. Die Durchführung einzelliger Kokulturexperimente mit mehreren Zelltypen mit den aktuellen mikrofluidischen Geräten ist jedoch immer noch eine Herausforderung, da die Poisson-Verteilung1,7,8oder die Unfähigkeit die Geräte, um mehr als zwei Arten von einzelnen Zellenzuerfassen 4,5,6,9,10.
Zum Beispiel berichteten Yoon et al. über ein mikrofluidisches Gerät für die Zell-Zell-Interaktionsstudie11. Dieses Gerät verwendet die probabilistische Methode, um Zellen in einer Kammer zu koppeln. Es kann jedoch nur die Kopplung von zwei verschiedenen Zelltypen aufgrund geometrischer Einschränkungen in der Gerätestruktur erreichen. Ein weiterer Bericht von Lee et al. zeigte eine deterministische Methode, einzelne Zellen zu erfassen und zu paaren12. Dieses Gerät erhöht die Kopplungseffizienz durch die deterministische Methode, ist jedoch durch die längere Betriebszeit begrenzt, die zum Koppeln von Zellen erforderlich ist. Insbesondere kann die zweite Zellaufnahme erst durchgeführt werden, nachdem die erste gefangene Zelle nach 24 h an die Oberfläche angeschlossen wurde. Zhao et al. berichteten von einem tropfenbasierten mikrofluidischen Gerät, um zwei Arten einer einzelnen Zelle zu erfassen13. Wir können feststellen, dass das tropfenbasierte mikrofluidische Gerät immer noch auf die Poisson-Verteilung beschränkt ist und nur auf nicht angeschlossenen Zellen verwendet werden kann, und es ist nicht möglich, die Kulturlösung während des Kultivierungsprozesses zu ändern.
Zuvor haben wir einen mikrofluidischen “hydrodynamischen Abschaltchip” entwickelt, der deterministische hydrodynamische Kräfte nutzt, um mehrere Arten von Einzelzellen in die Kulturkammer einzufangen und anschließend ein Zell-Kokulturexperiment durchführen kann, um individuelles Zellmigrationsverhalten unter Zell-Zell-Wechselwirkungen14. Der hydrodynamische Abschaltchip besteht aus einem arrayierten Einheitensatz, der jeweils einen Serpentin-By-Pass-Kanal, einen Capture-Site und eine Kulturkammer enthält. Durch die Verwendung des Differenzwiderstands zwischen dem Serpentin-Umgehungskanal und der Kulturkammer und einem speziell entwickelten Operationsverfahren können verschiedene Arten von Einzelzellen wiederholt in die Kulturkammer eingefangen werden. Insbesondere kann der große Raum der Kulturkammer nicht nur verhindern, dass die Zelle während der Zellaufnahme gespült wird, sondern auch genügend Raum für die Zellausbreitung, Vermehrung und Migration bieten, was die Beobachtung lebender einzelliger Wechselwirkungen ermöglicht. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die Produktion dieses Geräts und detaillierte Protokollschritte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die interzellulären Wechselwirkungen verschiedener Zellen in der Tumormikroumgebung spielen eine wichtige Rolle bei der Progression des Tumors17. Um den Mechanismus der Zell-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, werden Co-Kultur-Systeme als gemeinsame analytische Methode verwendet. Mehrere Zelltypen und die Heterogenität der Zellen selbst haben jedoch zu experimenteller Komplexität und analytischen Schwierigkeiten geführt.
Der hydrodynamische Abschaltchip ermöglicht …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (105-2628-E-400-001-MY2) und des Ph.D. Program in Tissue Engineering and Regenerative Medicine, National Chung Hsing University und National Health Research Institutes unterstützt.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
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