Summary
Этот метод включает в себя использование клинических диагностических данных для больных раком простаты для того, чтобы направлять процедуры отбора проб, когда биобанковская ткань после радикальной простатэктомии. Это преодолевает проблемы с ранее опубликованными методами, касающимися эффективности и доступности свежих тканей для более широкого спектра приложений ниже по течению.
Abstract
Предыдущие методы для биобанкинга ткани простаты, после радикальной простатэктомии, как правило, участвуют случайные выборки. В целях повышения эффективности и обеспечения более широкого спектра применения ниже по течению был разработан более целенаправленный метод отбора проб ткани простаты. Здесь мы используем как магнитно-резонансную томографию (МРТ), так и данные биопсии для таргетинга на конкретные области органа для отбора проб. Метод включает в себя использование ранее опубликованного устройства нарезки простаты, которое удаляет 5 мм поперечный ломтик из заданной области простаты, а затем удаление 6 мм бип-биопсии из заранее определенных областей этого ломтика. Эти образцы могут храниться замороженными или фиксированными для биобанкинговых целей, или использовать свежие сразу же с 70% уверенностью содержания опухоли, по сравнению с 10% уверенностью от случайного подхода выборки. Это позволяет использовать все стандартные методы вниз по течению, такие как геномика, протеомика или гистологическая работа, но и работа, которая требует свежих тканей, таких как изображения живой ткани или ex vivo культуры.
Introduction
Доступ к высококачественной ткани рака простаты человека является ключевым требованием для проведения эффективных исследований в этой области. Есть ряд существующих методов для образца ткани простаты после радикальной простатэктомии для исследования. Как правило, они включают в себя использование пунша биопсии взять случайные образцы из свежих, замороженных или фиксированных ломтик ткани простаты, и ретроспективно подтверждающие или нет опухоль присутствует в каждом образце гематоксилин и эозин (H и E), как оценивается уропатолог1,2,3,4,5. Недавний обзор составил обзор этих существующих методов6. Эти методы полезны для некоторых приложений ниже по течению, где ткани могут храниться и оцениваться по содержанию опухоли на более поздний срок, такие как крупномасштабные геномные анализы, такие как Международный консорциум генома рака (ICGC) и Атлас генома рака (TCGA) 4,7. Тем не менее, эти методы могут быть улучшены, если мы должны были использовать магнитно-резонансную томографию (МРТ) и / или биопсии данных для целевых конкретных областях простаты для отбора проб. Это позволит улучшить методологию двумя способами; во-первых, за счет сокращения количества собранных образцов тканей, повышения эффективности и снижения нагрузки на патологические отделения и стоимость хранения, а во-вторых, путем немедленного использования свежей ткани без необходимости немедленного подтверждения содержание опухоли, для новых современных технологий вниз по течению, таких как живая обработка тканей, органоидное поколение или культура ex vivo. Эта потребность исследования привела к развитию PEOPLE (PatiEnt prOstate samPLes для rEsearch) метод, и результаты из первых 84 случаев биобанксированных с использованием PEOPLE были недавно опубликованы8. Вариант этого метода также был опубликован с трехмерным (3D) печатных нарезки аппарата и пациента конкретных плесени, для того, чтобы облегчить ex vivo МРТ на предварительной и пост-фиксации ткани9,10.
Protocol
Протокол придерживается местных руководящих принципов и утверждается Комитетом по этике исследований биобанка UCL/UCLC (Справка 15/YH/0311).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этот метод включает в себя выборку тканей человека, все местные процедуры, касающиеся этики и согласия, должны соблюдаться до начала протокола. Случаи радикальной простатэктомии могут быть включены, если данные МРТ и биопсии доступны перед операцией, с диаметром опухоли 5 мм. Случаи заболевания следует исключить, если индекс поражения не определено, т.е. только диффузные изменения видны МРТ.
1. Нарезка простаты Аппарат
- Приобретите нарезной аппарат простаты(Таблица материалов). Кроме того, распечатать ручку лезвия с помощью 3D-принтера, как ранее опубликовано10.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство и одноразовые лезвия, используемые здесь, были приобретены по соглашению о передаче материалов из Института исследований рака, Лондон, Великобритания.
2. Таргетирование опухолей
- Обзор клинических примечаний для определения индексного поражения, о чем свидетельствует диагностическая биопсия, например, левый задний.
- Просмотрите МРТ-изображения для измерения местоположения вышеуказанной опухоли.
- Найдите последовательность, где опухоль наиболее заметна в осевой плоскости, например, T2-взвешенный.
- Прокрутите осевые изображения, чтобы найти изображение, где опухоль является крупнейшим и распечатать изображение для справки.
- На соответствующем корональном изображении измеряйте расстояние от основания простаты до выбранного осевого положения, а также полную длину простаты от вершины до основания (мм) и печатайте для справки.
3. Коллекция pProstate
- Проверьте заметки пациента, чтобы убедиться, что соответствующее информированное согласие было получено для этой процедуры и любых приложений исследования ниже по течению.
- После радикальной простатэктомии, собирать проставку в сухой кастрюле. Убедитесь, что не формалин или другой фиксатор был добавлен к простате.
- Перенос в подходящее стерильное место для взятия проб, например, ламинарный капот в патологическую лабораторию.
- Приступить к отбору проб как можно скорее, если требуется свежая ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых применений (например, оценка ДНК, которая не должна деградировать так же быстро, как РНК), может быть целесообразным хранить образец в холодильнике и брать пробы на следующий день.
4. Подготовка образцов
- Подготовка ламинарного потока капот и простаты нарезки аппарата в соответствии с местными процедурами обеззараживания, используя стерильную технику. Здесь распылите 70% этанола и протрите все поверхности. Используйте стерильные одноразовые иглы и скальпели. Используйте лезвия слайсера до трех раз; мыть после каждого использования в горячей мыльной воде, затем спрей и протрите 70% этанола.
- Взвешивание простаты (g) с помощью стандартной шкалы.
- Чернила простаты. Краска левой стороне с синими чернилами и правой стороны с черными чернилами. Обложка полной капсулы и семенных пузырьков с чернилами, чтобы позже обозначить хирургические поля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры почернению могут меняться на местном уровне и могут быть соответствующим образом изменены.
5. Нарезка простаты
- Соберите нарезной аппарат, вставив стены перпендикулярно в основание стенда(рисунок 1А).
- Поместите проста так, чтобы основание и вершина обращены к противоположным стенам, с задней стороной вниз и передней вверх. Поместите золотые булавки вокруг простаты. Нажмите простаты внутрь немного, если это необходимо, чтобы получить уютно подходят, которые будут поддерживать протоиели во время нарезки.
- Измерьте длину простаты от основания к вершине, используя линейку, и сравните с длиной простаты, измеряемой МРТ. Если простата сократилась, примените специальное исправление на ожидаемое расстояние от основания до целевого поперечного среза. Например, если общая длина простаты на МРТ-изображении составляет 50 мм, но при измерении с линейкой в этот момент она сократилась до 45 мм, уменьшите ожидаемое положение нарезки на 10%.
- Измерьте от основания к пожеланной поперечной части. Выберите штифт, который находится ближе всего к этому измерению, чтобы нарезать вокруг.
- Ношение цепной почты перчатки для предотвращения травм, держать нарезки устройства (Рисунок 1B), место лезвия по обе стороны от определены булавки и использовать прокладку держать лезвия 5 мм друг от друга. Возьмите ломтик медленно и твердо движущихся лезвий вниз, вперед и назад с длинными штрихами(Рисунок 1C). Убедитесь, что полный срез был отделен перед разборкой аппарата.
- Удалите стены и булавки и осторожно выньте ломтик на стерильный лист пробковой доски с помощью перчаток.
6. Выборка тканей
- Визуально осмотрите поперечный срез и сравните с изображением осевой МРТ. В некоторых случаях область опухоли может казаться более бледной, чем окружающая ткань.
- Палпатпопопов поперечный ломтик осторожно. В некоторых случаях опухоль может чувствовать себя тверже, чем окружающие ткани.
- Используя изображение осевой МРТ в качестве руководства, выберите одну или несколько областей для отбора проб.
-
Возьмите биопсии удары желаемой области ткани.
- Используя 6-мм пунш, нажимайте вниз на нужную область ткани.
- Твист ткани удар на месте и вниз против пробки, чтобы обеспечить полное разделение и использовать острый скальпель, чтобы отделить, если это необходимо.
- Удалите пунш и поместите в трубки / формы по мере необходимости путем выброса с помощью поршеня.
- Повторите для дальнейшей опухоли и доброкачественных образцов по мере необходимости, с отдельными стерильной биопсии ударов. Чернила отверстия, где удары были приняты в красном.
- Обратите внимание на расположение каждого удара вместе с весом простаты и любые наблюдения по цвету ткани / твердости.
7. Представление простаты для местной диагностики
- Прикрепите прокладку к пробке с стерильными одноразовыми иглами до фиксации, чтобы предотвратить усадку тканей и деформацию, что может изменить внешний вид хирургических краев.
- После прижимая к пробке, представить проста в отделение гистопатологии для стандартной клинической диагностики.
8. Обеззараживание аппарата
- Отбросьте все одноразовое оборудование в биомедицинских отходах и/или острого контейнера, как это определено на местном уровне.
- Обеззараживание ламинарного потока капота и нарезки простаты в соответствии с местными оценками риска, подходящими для тканей человека (например, путем распыления 70% EtOH и вытирания).
Representative Results
Свежие ткани простаты, отобранные с помощью метода PEOPLE, могут быть использованы для различных методов, включая геномного секвенирования и культуру ex vivo. Первые 59 случаев, отобранных с использованием этого метода, были ранее опубликованы по сравнению с более ранней версией метода, наряду с первоначальными данными вниз по течению8. Время от первой нарезки простаты до замораживания/фиксации биопсии пунша здесь составляло примерно 1 минуту, которая была сведена к минимуму, чтобы избежать деградации РНК. Время от удаления простаты до нарезки простаты также должно быть сведено к минимуму, хотя здесь это заняло около 20 минут из-за нашего театра и патологии лабораторий, нахиднунных в разных местах.
В зависимости от применения вниз по течению, как правило, по крайней мере два образца взяты: один из области ожидаемой ткани опухоли и один из области ожидаемого доброкачественной ткани. Ключевым показателем успеха самого метода отбора проб является оценка содержания опухоли в данном образце.
Для вступления в проект 100 000 геномов секция окрашенных тканей Н и Е должна быть оценена уропатологом, а образец должен содержать не менее 40% опухолевых клеток. Образцы, содержащие менее 40% опухоли, все еще могут быть включены в проект, если они успешно макроноскрыты. Из первых 92 случаев, отобранных таким образом, 64% содержали по крайней мере 40% опухоли и были представлены в 100000 Геномов проекта без макродиссекции. ДНК была извлечена и была достаточной урожайности и качества во всех случаях(таблица 1). Первоначальная подмножество из 59 из этих образцов была ранее опубликована по сравнению с более ранним методом8.
Для культуры ex vivo, сопоставленная опухоль и доброкачественная ткань должны быть достаточного качества, чтобы выдерживать культуру 72 ч без значительной деградации. Несколько образцов тканей из в общей сложности трех пациентов были успешно культивированы8.
Рисунок 1: Нарезка простаты аппарата. Этот аппарат был получен по договору передачи материалов от Института онкологических исследований. (A) Стены вставляются перпендикулярно к основанию, и золотые булавки вставляются в основание, окружающее проста (простата не на фото). (B) Заменяемые параллельные лезвия вставляются в ручку лезвия. (C) лезвия проходят между золотыми булавками для того, чтобы нарезать 5 мм раздел простаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| n (%) | |
| Хит (зт/г;40% опухоли) | 59 (64%) |
| Частичный удар (5-30% опухоли) | 6 (7%) |
| Мисс (0% опухоли) | 27 (29%) |
| Общая | 92 (100%) |
Таблица 1: Скорость попадания опухоли. Скорость попадания опухоли была определена консультантом патологоанатом, специализирующимся на раке предстательной железы, после обзора Н И Е окрашенных тканей. Содержание опухолевых клеток в размере 40% было определено, чтобы быть пригодным для включения в 100000 геномов проекта, в рамках принципов Genomics Англии.
Discussion
Критические шаги в рамках этого протокола включают идентификацию опухолевой области для отбора проб, измерения простаты и взятия проб тканей. Во-первых, ключевым моментом является измерение МРТ для определения правильной области выборки. Мы демонстрируем этот метод в сопроводительном видео; однако, мы также рекомендуем подтвердить измерения с радиологом в первую очередь. Четкие клинические заметки, которые указывают исследователя в области МРТ изображения, которые содержат индекс поражения являются идеальными. Во-вторых, измерение простаты должно проводиться с осторожностью, гарантируя, что линейка проводится под углом для измерения полной длины от основания до вершины, параллельно передней простаты. В-третьих, опухолевые участки должны быть подтверждены до отбора проб путем визуального осмотра фрагмента ткани по отношению к исходному изображению МРТ, пальпирования ткани (в некоторых случаях область опухоли может чувствовать себя более плотной), и визуально оценивая цвет ткани (в некоторых случаев опухоль будет выглядеть более бледной, чем окружающие доброкачественные ткани).
Этот протокол был выполнен в полном объеме в UCL/UCLH неклиническими постдокторскими исследователями, стипендиатом патологии, консультантами по патологии и техническими специалистами. По нашему опыту, все этапы протокола могут быть изучены в менее чем десяти случаях, независимо от технической подготовки. Тем не менее, мы рекомендуем обучение у радиолога относительно измерения МРТ и обучение у патологоанатома в отношении нарезки в первую очередь. Протокол может быть изменен с помощью 3D печатной нарезки ручки, как ранее опубликовано10.
Потенциальные ограничения методики включают риск покоя при постановке диагноза. Нарезка простаты является ключевым шагом, который может препятствовать на классификации или положительные ставки маржи, если сделано неправильно. Здесь есть две потенциальные проблемы. Во-первых, если все индексные повреждения удаляются и используются для экспериментов с свежей тканью немедленно, рутинная клиническая диагностика не будет проводиться для этого поражения и пациент может быть неправильно диагностирован как имеющий рак более низкого класса. Чтобы избежать этого, исследователь должен обсудить план отбора проб с консультантом патологоанатом, который будет регулярно рассматривать случай, до отбора проб, и согласовать количество и местоположение образцов, которые должны быть приняты. Небольшие опухоли могут быть исключены локально по этой причине. Во-вторых, если простатическая капсула не прижата вниз правильно пробки борту до фиксации, это может позволить внутренней ткани выпуклость наружу во время фиксации, изменяя хирургические поля. Это может привести к ложноположительной маржи, где остальные опухоли, как представляется, проживают в капсуле чисто из-за деформации тканей.
Значение этой техники по отношению к существующим методам заключается в основном в таргетинге опухолей. На сегодняшний день опубликован ряд методов отбора проб радикальных образцов простатэктомии; однако, все это зависит от полностью или частично случайного подхода выборки1,2,3,4,5,6,7. Использование биопсии и, в частности, данные МРТ здесь повысило эффективность, что позволило уменьшить выборку с повышенной достоверностью получения опухолевой ткани8.
Будущие применения этого метода позволяют применять более широкий спектр методов, расположенных ниже по течению, чем при предыдущих методах отбора проб. Например, наличие свежей ткани, которая имеет высокую вероятность быть опухолью означает, что более дорогие и / или трудоемких свежих тканей методы могут быть использованы, так как многие образцы не требуется для обеспечения присутствия опухоли. Это может включать в себя и не ограничивается, ex vivo культуры, ex vivo МРТ, передовые изображения и транскриптомики.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать рака предстательной железы Великобритании для финансирования SH в рамках рака предстательной железы Великобритании Центр передового опыта и путешествия премии стипендий (TLD-PF16-004) и HP в соответствии с INNOVATE (PG14-018-TR2). Эта работа была поддержана исследователями из Национального института медицинских исследований Университетского колледжа Лондона Больницы Биомедицинский исследовательский центр.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
- Sooriakumaran, P., Henderson, A., Denham, P., Langley, S. E. A novel method of obtaining prostate tissue for gene expression profiling. International Journal of Surgical Pathology. 17 (3), 238-243 (2009).
- Jhavar, S. G., et al. Processing of radical prostatectomy specimens for correlation of data from histopathological, molecular biological, and radiological studies: a new whole organ technique. Journal of Clinical Pathology. 58 (5), 504-508 (2005).
- Wheeler, T. M., Lebovitz, R. M. Fresh tissue harvest for research from prostatectomy specimens. The Prostate. 25 (5), 274-279 (1994).
- Esgueva, R., et al. Next-generation prostate cancer biobanking: toward a processing protocol amenable for the International Cancer Genome Consortium. Diagnostic Molecular Pathology. 21 (2), 61-68 (2012).
- Dev, H., et al. Biobanking after robotic-assisted radical prostatectomy: a quality assessment of providing prostate tissue for RNA studies. Journal of Translational Medicine. 9, 121 (2011).
- Tolkach, Y., et al. Blind Biobanking of the Prostatectomy Specimen: Critical Evaluation of the Existing Techniques and Development of the New 4-Level Tissue Extraction Model With High Sampling Efficacy. The Prostate. 77 (4), 396-405 (2017).
- Warren, A. Y., et al. Method for sampling tissue for research which preserves pathological data in radical prostatectomy. The Prostate. 73 (2), 194-202 (2013).
- Heavey, S., et al. PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch, a tissue collection pathway utilizing magnetic resonance imaging data to target tumor and benign tissue in fresh radical prostatectomy specimens. The Prostate. 79 (7), 768-777 (2019).
- Bailey, C., et al. VERDICT MRI validation in fresh and fixed prostate specimens using patient-specific moulds for histological and MR alignment. NMR in Biomedicine. 32 (5), 4073 (2019).
- Bourne, R. M., et al. Apparatus for Histological Validation of In Vivo and Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging of the Human Prostate. Frontiers in Oncology. 7, 47 (2017).
