Brug af magnetisk resonansbilleddannelse og biopsi data til at vejlede prøveudtagningsprocedurer for prostata cancer Biobanking

Summary

Denne metode indebærer udnyttelse af kliniske diagnostiske data for prostatacancer patienter for at vejlede prøveudtagningsprocedurer, når biobanking væv efter radikal prostatektomi. Dette overvinder problemer med tidligere offentliggjorte metoder omkring effektivitet og tilgængelighed af fersk væv for en bredere vifte af downstream-applikationer.

Abstract

Tidligere metoder til biobanking prostata væv, efter radikal prostatektomi, generelt involveret tilfældig prøvetagning. For at øge effektiviteten og muliggøre et større udvalg af downstream-applikationer blev der udviklet en mere målrettet metode til prøvetagning af prostata væv. Her bruger vi både magnetisk resonans imaging (MRI) og biopsi data til at målrette specifikke områder af organet til prøvetagning. Metoden indebærer brug af en tidligere offentliggjort prostata udskæring anordning, som fjerner en 5 mm tværsnit skive fra en forudbestemt region af prostata, efterfulgt af fjernelsen af 6 mm punch biopsier fra forudbestemte områder af denne skive. Disse prøver kan opbevares frosset eller fast til biobanking formål, eller anvendes friske straks med 70% tillid til tumor indhold, sammenlignet med 10% tillid fra stikprøveudtagning tilgang. Dette gør det muligt at anvende alle standard downstream-teknikker såsom genomforskning, proteomik eller histologisk arbejde, men også arbejde, der kræver fersk væv såsom levende vævs dannelse eller ex vivo-kultur.

Introduction

Adgang til høj kvalitet humant prostatacancer væv er et centralt krav for at køre effektiv forskning på området. Der er en række eksisterende metoder til at prøve prostata væv efter radikal prostatektomi for forskning. Typisk disse involverer ved hjælp af punch biopsier til at tage tilfældige prøver fra en frisk, frosset eller fast skive af prostata væv, og retrospektivt bekræfter, om tumor er til stede i hver prøve ved hematoxylinlegemer & eosin (H & E) som vurderet af en uropatolog^1,2,3,4,5. En nylig gennemgang har samlet en oversigt over disse eksisterende metoder⁶. Disse metoder er nyttige for visse downstream-anvendelser, hvor væv kan lagres og vurderes for tumor indhold på et senere tidspunkt, såsom stor skala genomanalyser som international Cancer Genome Consortium (ICGC) og cancer Genome Atlas (TCGA) ^4,7. Men, disse metoder kunne forbedres på i hvis vi skulle bruge magnetisk resonans imaging (MRI) og/eller biopsi data til at målrette specifikke områder af prostata til prøvetagning. Dette vil forbedre metodologien på to måder; for det første ved at reducere antallet af indsamlede vævsprøver, øge effektiviteten og reducere presset på patologiske afdelinger og oplagringsomkostninger og for det andet ved at tillade, at fersk væv anvendes straks uden behov for øjeblikkelig bekræftelse af tumor indhold, for nye state of the art downstream teknologier såsom levende væv Imaging, organoid generation eller ex vivo kultur. Dette forskningsbehov har ført til udviklingen af de mennesker (PatiEnt prostata prøver til forskning) metode, og resultaterne fra de første 84 tilfælde biobanked ved hjælp af mennesker blev for nylig offentliggjort⁸. En variation af denne metode er også blevet offentliggjort med en tredimensionel (3D) trykt udskæring apparater og patient-specifikke skimmel, for at lette ex vivo MRI på præ-og post-fikserings vævet^9,10.

Protocol

Protokollen overholder lokale retningslinjer og er godkendt af UCL/UCLC biobank Forskningsetiske Komité (reference 15/YH/0311).

Bemærk: Da denne metode omfatter prøvetagning af humant væv, skal alle lokale procedurer vedrørende Etik og samtykke overholdes forud for indledningen af protokollen. Radikale prostatektomi tilfælde kan være inkluderet, hvis både MRI og biopsi data er tilgængelige forud for kirurgi, med tumor diameter ≥ 5 mm. tilfælde bør udelukkes, hvis indeks læsionen ikke er veldefineret, dvs kun diffuse ændringer er synlige ved MRI.

1. apparater til prostata udskæring

1. Køb prostata udskæring-apparatet (tabel over materialer). Alternativt kan du udskrive et klinge håndtag ved hjælp af en 3D-printer som tidligere udgivet¹⁰.
   Bemærk: Enheden og engangs bladene, der anvendes her, blev købt under materiale overførselsaftale fra Institute of Cancer Research, London, UK.

2. tumor målretning

1. Gennemgå kliniske noter for at identificere indekslæsion som indikeret ved diagnostisk biopsi, f. eks, venstre posterior.
2. Gennemgå MRI-billeder for at måle placeringen af ovennævnte tumor.
   1. Find sekvensen, hvor tumoren er mest synlig i det aksiale plan, fx T2-vægtet.
   2. Rul gennem aksiale billeder for at finde det billede, hvor tumoren er størst, og Udskriv billede til reference.
   3. I den tilsvarende koronal billede, måle afstanden fra bunden af prostata til den valgte aksiale position, og den fulde længde af prostata fra spids til Base (mm), og udskrive til reference.

3. samling af Pprostata

1. Kontrollér patient noterne for at sikre passende informeret samtykke til denne procedure og eventuelle downstream-forsknings applikationer.
2. Efter radikal prostatektomi, indsamle prostata i en tør gryde. Sørg for, at der ikke er tilsat nogen form Alin eller andre fikat opløsninger til prostata.
3. Overfør til et egnet sterilt sted til prøvetagning, fx en laminar flow hætte i et patologisk laboratorium.
4. Fortsæt til prøvetagning så hurtigt som muligt, hvis der er behov for fersk væv.
   Bemærk: For visse anvendelser (f. eks. vurdering af DNA, som ikke bør nedbrydes så hurtigt som RNA), kan det være hensigtsmæssigt at opbevare prøven i køleskab og tage prøverne næste dag.

4. klargøring af præparatet

1. Forbered laminar flow hætte og prostata udskæring apparater i henhold til lokale dekontamineringsprocedurer, ved hjælp af steril teknik. Her spray 70% ethanol og tørres på tværs af alle overflader. Brug sterile engangsnåle og Scalpels. Brug udsnitsklinger op til tre gange; vask efter hver brug i varmt sæbevand, derefter spray og tørres med 70% ethanol.
2. Afvejes prostata (g) ved hjælp af en Standardskala.
3. Blæk prostata. Mal venstre side med blåt blæk og højre side med sort blæk. Dæk den fulde kapsel og skelsættende vesikler med blæk til senere betegner de kirurgiske margener.
   Bemærk: Inking procedurer kan variere lokalt og kan ændres i overensstemmelse hermed.

5. prostata udskæring

1. Monter udsnitnings apparatet ved at anbringe væggene vinkelret i foden af stativet (figur 1A).
2. Placer prostata, så basen og spidsen vender mod modsatte vægge, med den bageste side nedad og forreste opad. Placer guld stifter omkring prostata. Push prostata indad lidt om nødvendigt for at få en tætsiddende pasform, som vil støtte prostata under udskæring.
3. Mål prostata længde fra base til spids, ved hjælp af en lineal, og Sammenlign med prostata længde som målt ved Mr. Hvis prostata er skrumpet, skal du anvende en ad hoc korrektion til den forventede afstand fra base til mål tværgående skive. For eksempel, hvis den fulde længde af prostata i MRI-billedet er 50 mm, men når målt med en lineal på dette punkt er skrumpet til 45 mm, reducere den forventede udskæring position med 10%.
4. Mål fra bunden til det ønskede tværsnit. Vælg den pinkode, der sidder tættest på denne måling, for at skære rundt.
5. Iført Chainmail handsker for at forhindre skade, hold udskæring enhed (figur 1B), Placer blade hver side af den identificerede PIN og bruge afstandsstykket til at holde bladene 5 mm fra hinanden. Tag skive ved at bevæge knivene langsomt og forsigtigt nedad, fremad og bagud med lange strøg (figur 1C). Sørg for, at en fuld skive er blevet adskilt inden demontering af apparatet.
6. Fjern vægge og stifter, og Tag forsigtigt udsnittet ud på et sterilt ark kork plade med handsker.

6. vævs prøvetagning

1. Undersøg visuelt det tværgående udsnit, og Sammenlign med det aksiale MRI-billede. I nogle tilfælde kan tumor området synes bleer end omgivende væv.
2. Palpere den tværgående skive forsigtigt. I nogle tilfælde kan tumoren føles fastere end det omgivende væv.
3. Brug det aksiale MRI-billede som en hjælpelinje, og vælg et eller flere områder til prøvetagning.
4. Tag biopsi slag af ønskede område af væv.
   1. Brug en 6 mm punch, Tryk ned på det ønskede område af væv.
   2. Drej vævs punch på stedet og ned mod proppen for at sikre fuld adskillelse og brug en skarp skalpel til at adskille om nødvendigt.
   3. Fjern punch og Placer i rør/forme efter behov ved at skubbe ved hjælp af stemplet.
   4. Gentag for yderligere tumor og godartede prøver efter behov, med separate sterile biopsi punches. Blæk hullerne, hvor slag blev taget i rødt.
   5. Bemærk placeringen af hver punch sammen med vægten af prostata og eventuelle observationer på vævs farve/fasthed.

7. indsendelse af prostata til lokal diagnostik

1. Fastgør prostata til kork med sterile engangsnåle før fiksering for at forhindre vævs svind og vridning, hvilket kan ændre udseendet af de kirurgiske margener.
2. Efter fastgørelse til kork, indsende prostata til histopatologiske afdeling for standard klinisk diagnostik.

8. dekontaminering af apparatur

1. Kassér alt engangsudstyr i biomedicinske affaldsstrømme og/eller skarpe beholdere som lokalt udpegede.
2. Laminar flow hætten og prostata udskæring-apparatet dediskes i overensstemmelse med lokale risikovurderinger, som er passende for humant væv (f. eks. ved sprøjtning med 70% EtOH og aftørring).

Representative Results

Frisk prostata væv, der udtages prøver af metoden PEOPLE, kan anvendes til en lang række downstream-teknikker, herunder genomsekvensering og ex vivo-kultur. De første 59 tilfælde, hvor denne metode blev udtaget, er tidligere blevet offentliggjort sammenlignet med en tidligere version af metoden sammen med de oprindelige downstream-data⁸. Tiden fra første skæring prostata til frysning/fastsættelse punch biopsier her var ca 1 min, som blev holdt på et minimum for at undgå nedbrydning af RNA. Tid fra fjernelse af prostata til prostata udskæring bør også holdes på et minimum, selvom her dette tog ca. 20 min på grund af vores teater og patologi Labs at være i forskellige steder.

Afhængigt af downstream-applikationen udtages typisk mindst to prøver: en fra et område af forventet tumor væv og en fra et område af forventet godartet væv. Det vigtigste mål for succes for stikprøvemetoden i sig selv er at vurdere tumor indholdet i en given prøve.

For indrejse i 100.000 genomer projektet, en H & E farvede væv afsnit skal vurderes af en uropatolog, og prøven skal indeholde mindst 40% tumorceller. Prøver, der indeholder mindre end 40% tumor kan stadig indgå i projektet, hvis de er med held makrodissekeret. Af de første 92 tilfælde i stikprøven på denne måde, 64% indeholdt mindst 40% tumor og blev indsendt til 100.000 genomer projekt uden macrodissection. DNA blev ekstraheret og var af tilstrækkelig udbytte og kvalitet i alle tilfælde (tabel 1). En første delmængde af 59 af disse prøver blev tidligere offentliggjort i sammenligning med en tidligere metode⁸.

For ex vivo-kulturen skal matchet tumor og godartet væv være af tilstrækkelig kvalitet til at modstå 72 h-kulturen uden signifikant nedbrydning. Flere vævsprøver fra i alt tre patienter blev dyrket med succes⁸.

Figur 1: apparater til udsnitning af prostata. Dette apparat blev opnået i henhold til materiale overførsels aftalen fra Institute of Cancer Research. (A) væggene er indsat vinkelret på basen, og guld stifter er indsat i bunden omkring prostata (prostata ikke afbilledet). B) de udskiftelige parallelle klinger indsættes i kniv håndtaget. (C) knivene passerer mellem guld stifterne for at skære en 5 mm del af prostata. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

	n (%)
Hit (> 40% tumor)	59 (64%)
Partielt hit (5-30% tumor)	6 (7%)
Miss (0% tumor)	27 (29%)
Samlede	92 (100%)

Tabel 1: tumor hit rate. Tumor hit sats blev bestemt af en konsulent patolog med speciale i prostatakræft, efter gennemgang af H & E farvede væv. Tumor celleindhold af > 40% var fast besluttet på at være egnet til optagelse i 100.000 genomer projekt, som pr Genomics England retningslinjer.

Discussion

Kritiske trin i denne protokol omfatter identifikation af tumor region for prøvetagning, måling af prostata, og vævs prøvetagning. For det første er måling af MRI for at identificere det korrekte område af prøveudtagningen afgørende. Vi demonstrerer denne metode i den medfølgende video; men vi anbefaler også at bekræfte målinger med en radiolog i første omgang. Klare kliniske noter, som peger forskeren mod området af MRI billeder, der indeholder indekset læsion er ideelle. For det andet, måling af prostata bør udføres med omhu, at sikre, at linealen holdes i en vinkel for at måle den fulde længde fra base til spids, parallelt med den forreste af prostata. For det tredje bør tumor områder bekræftes forud for prøvetagning ved visuelt at inspicere vævs skive i forhold til det oprindelige MRI-billede, palpere vævet (i nogle tilfælde tumor området kan føle sig mere tætte), og visuelt vurdere farven på vævet (i nogle tilfælde tumoren vil fremstå mere bleg end omgivende godartet væv).

Denne protokol er blevet gennemført fuldt ud på UCL/UCLH af ikke-kliniske postdoktorale forskere, en patologi stipendiat, patologiske konsulenter og forsknings teknikere. I vores erfaring kan alle trin i protokollen læres i under ti tilfælde uanset teknisk baggrund. Vi anbefaler dog, at der undervisning fra en radiolog om MRI-måling og træning fra en patolog om udskæring i første omgang. Protokollen kan ændres ved hjælp af et 3D-trykt udskæring-håndtag, som tidligere udgivet¹⁰.

Potentielle begrænsninger af teknikken omfatter risikoen for at hæmme diagnosen. Udskæring af prostata er et vigtigt skridt, som kan hæmme på sortering eller positive margin satser, hvis det gøres forkert. Der er to potentielle problemer her. For det første, hvis alle indekslæsion fjernes og anvendes til frisk væv eksperimenter straks, rutinemæssig klinisk diagnostik vil ikke blive udført for denne læsion og patienten kan blive fejldiagnosticeret som havende en lavere grad kræft. For at undgå dette bør forskeren drøfte prøveudtagningsplanen med konsulent patologen, som rutinemæssigt vil gennemgå sagen, før prøveudtagningen, og blive enige om antallet og placeringen af de prøver, der skal udtages. Små tumorer kan udelukkes lokalt af denne grund. For det andet, hvis den prostatiske kapsel ikke er fastgjort korrekt til Korkplader forud for fiksering, dette kunne tillade det inderste væv til at bule udad under fiksering, ændre de kirurgiske margener. Dette kunne føre til en falsk positiv margin, hvor den resterende tumor synes at opholde sig på kapslen udelukkende på grund af vævs vridning.

Betydningen af denne teknik med hensyn til eksisterende metoder ligger hovedsageligt med tumor målretning. En række metoder til prøvetagning af radikale prostatektomi enheder er blevet offentliggjort til dato; disse er dog alle afhængige af en helt eller delvis stikprøveudtagning tilgang^{1,2,3,4,5,6,7}. Brugen af biopsi og især MRI data her har forbedret effektivitet, giver mulighed for reduceret prøvetagning med øget tillid til at opnå tumor væv⁸.

Fremtidige anvendelser af denne metode giver mulighed for at vedtage en bredere vifte af downstream-teknikker end med tidligere prøvetagningsmetoder. For eksempel, tilgængeligheden af fersk væv, der har en høj sandsynlighed for at være tumor betyder, at dyrere og/eller arbejdskraftintensive friske væv teknikker kan udnyttes, da mange prøver ikke er forpligtet til at sikre tilstedeværelsen af tumor. Dette kan omfatte og er ikke begrænset til ex vivo-kultur, ex vivo MRI, avanceret billeddannelse og transkriptomik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 mm biopsy punch	Fisher Scientific	13404607	Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples
Black Ink	Leica Biosystems	3801753	Tissue marking & margin dye
Blue Ink	Leica Biosystems	3801751	Tissue marking & margin dye
Chainmail hand glove	Arco	1456803	Chainmail gloves to protect hand during slicing
Cork board	Fisher Scientific	12396447	Cork board for pinning prostate to following sampling procedure
Needles	SLS (Scientific Laboratory supplies)	SYR6112	Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling
Prostate slicing aparatus	Insitute of Cancer Research, London	NA - must be obtained under MTA	A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins