Summary
Deze methode omvat het gebruik van klinische diagnostische gegevens voor patiënten met prostaatkanker om bemonsteringsprocedures te begeleiden, wanneer biobankingen weefsel na radicale prostatectomie. Dit overkomt problemen met eerder gepubliceerde methoden rond efficiëntie en beschikbaarheid van vers weefsel voor een breder scala van downstream toepassingen.
Abstract
Vorige methoden voor biobankingen prostaatweefsel, na radicale prostatectomie, over het algemeen betrokken willekeurige bemonstering. Om de efficiëntie te verhogen en een groter bereik van downstreamtoepassingen mogelijk te maken, werd een meer gerichte methode voor het bemonsteren van prostaatweefsel ontwikkeld. Hier gebruiken we zowel Magnetic Resonance Imaging (MRI) als biopsie data om specifieke gebieden van het orgel te targeten voor bemonstering. De methode omvat het gebruik van een eerder gepubliceerde prostaat snijden apparaat dat een 5 mm dwarse segment uit een vooraf bepaalde regio van de prostaat verwijdert, gevolgd door het verwijderen van 6 mm Punch biopsieën uit vooraf bepaalde gebieden van dit segment. Deze monsters kunnen worden opgeslagen bevroren of vast voor biobankingen doeleinden, of vers onmiddellijk gebruikt met 70% vertrouwen van de tumor inhoud, in vergelijking met 10% vertrouwen van de willekeurige bemonstering aanpak. Dit maakt het gebruik mogelijk van alle standaard downstreamtechnieken zoals Genomics, proteomica of histologisch werk, maar ook werk dat vers weefsel vereist, zoals Live weefsel Imaging of ex vivo cultuur.
Introduction
Toegang tot hoogwaardig menselijk prostaatkanker weefsel is een belangrijke vereiste voor het stimuleren van effectief onderzoek op het gebied. Er zijn een aantal bestaande methoden om te proeven van prostaatweefsel na radicale prostatectomie voor onderzoek. Meestal gaat het om het gebruik van Punch biopsieën om willekeurige monsters te nemen van een vers, bevroren of vast plakje prostaatweefsel, en achteraf te bevestigen of tumor aanwezig is in elk monster door hematoxyline & eosine (H & E) zoals beoordeeld door een uropatholoog1,2,3,4,5. Een recente beoordeling heeft een overzicht van deze bestaande methoden6samengesteld. Deze methoden zijn nuttig voor bepaalde downstreamtoepassingen, waarbij weefsel op een later tijdstip kan worden opgeslagen en beoordeeld op tumor inhoud, zoals grootschalige genomische analyses zoals het International Cancer Genome Consortium (ICGC) en de Cancer Genome Atlas (TCGA) 4,7. Deze methoden kunnen echter worden verbeterd wanneer we magnetische resonantie imaging (MRI) en/of biopsie gegevens gebruiken om specifieke gebieden van de prostaat te targeten voor bemonstering. Dit zou de methodologie op twee manieren verbeteren; Ten eerste, door het aantal verzamelde weefselmonsters te verminderen, de efficiëntie te verhogen en de druk op pathologie-afdelingen en de opslagkosten te verminderen, en ten tweede door toe te staan dat vers weefsel onmiddellijk wordt gebruikt zonder dat onmiddellijke bevestiging van tumor inhoud, voor nieuwe state of the art downstream technologieën zoals Live weefsel beeldvorming, organoïde generatie of ex vivo cultuur. Dit onderzoek nodig heeft geleid tot de ontwikkeling van de mensen (patiënt prostaat monsters voor onderzoek) methode, en de resultaten van de eerste 84 gevallen biobanked met behulp van mensen werden onlangs gepubliceerd8. Een variatie van deze methode is ook gepubliceerd met een driedimensionale (3D) gedrukte snijden-apparaat en patiënt-specifieke mal, om ex vivo MRI op pre-en post-fixatie weefsel9,10te vergemakkelijken.
Protocol
Het protocol houdt zich aan de lokale richtlijnen en is goedgekeurd door de UCL/UCLC biobank Research Ethics Committee (referentie 15/YH/0311).
Opmerking: Aangezien deze methode de bemonstering van menselijk weefsel inhoudt, moeten alle lokale procedures met betrekking tot ethiek en toestemming vóór het begin van het protocol worden nageleefd. Radicale prostatectomie gevallen kunnen worden opgenomen als zowel MRI en biopsie gegevens beschikbaar zijn van tevoren van de operatie, met tumor diameter ≥ 5 mm. gevallen moeten worden uitgesloten als de index laesie niet goed gedefinieerd is, d.w.z. dat alleen diffuse veranderingen zichtbaar zijn door MRI.
1. apparatuur voor het snijden van prostaat
- Koop de prostaat-snijden apparatuur (tabel van de materialen). U ook een Blade-handle afdrukken met een 3D-printer zoals eerder gepubliceerd10.
Opmerking: Het apparaat en de wegwerpmesjes die hier gebruikt werden, werden aangekocht onder de Material Transfer Agreement van het Institute of Cancer Research, Londen, VK.
2. tumor targeting
- Bekijk klinische aantekeningen om de index laesie te identificeren zoals aangegeven door diagnostische biopsie, bijvoorbeeld, links posterior.
- Bekijk MRI-beelden om de locatie van de bovengenoemde tumor te meten.
- Zoek de sequentie waar de tumor het meest zichtbaar is in het axiale vlak, bijvoorbeeld T2-gewogen.
- Scroll door axiale afbeeldingen om de afbeelding te vinden waar de tumor het grootst is en druk afbeelding ter referentie af.
- Meet in het corresponderende coronale beeld de afstand van de basis van de prostaat tot de geselecteerde axiale positie, en de volledige lengte van de prostaat van Apex naar Base (mm), en print ter referentie.
3. verzameling van Pprostaat
- Controleer de opmerkingen van de patiënt om ervoor te zorgen dat de juiste geïnformeerde toestemming is verkregen voor deze procedure en eventuele downstreamonderzoekstoepassingen.
- Na radicale prostatectomie, verzamel de prostaat in een droge pot. Zorg ervoor dat er geen formaline of andere fixeer is toegevoegd aan de prostaat.
- Overdracht naar een geschikte steriele locatie voor bemonstering, bijvoorbeeld een laminaire stroom kap in een laboratorium voor pathologie.
- Ga zo snel mogelijk naar de bemonstering als er vers weefsel nodig is.
Opmerking: Voor bepaalde toepassingen (bijv. beoordeling van DNA dat niet zo snel moet degraderen als RNA), kan het geschikt zijn om het preparaat in de koelkast te bewaren en de volgende dag monsters te nemen.
4. preparaat
- Bereid laminaire stroom afzuigkap en prostaat-snijden apparatuur volgens lokale ontsmettingsprocedures, met behulp van steriele techniek. Spray hier 70% ethanol en veeg over alle oppervlakken. Gebruik steriele naalden voor eenmalig gebruik en scalpels. Gebruik slicerblades maximaal drie keer; was na elk gebruik in heet zeepwater, spray en veeg met 70% ethanol.
- Weeg de prostaat (g) af met een standaardschaal.
- Inkt de prostaat. Schilder de linker kant met blauwe inkt en rechterkant met zwarte inkt. Bedek de volledige capsule en zaadblaasjes met inkt om later de chirurgische marges aan te duiden.
Opmerking: Het inking van procedures kan lokaal verschillen en kan dienovereenkomstig worden gewijzigd.
5. prostaat snijden
- Monteer het snij apparaat door de wanden loodlijnen in de voet van de standaard te plaatsen (Figuur 1A).
- Plaats de prostaat zodanig dat de basis en de Apex tegenover de wanden staan, met de achterste kant naar beneden en voorste. Plaats gouden pinnen rond de prostaat. Duw de prostaat naar binnen lichtjes als dat nodig is om een nauwsluitende pasvorm te krijgen, die de prostaat tijdens het snijden zal ondersteunen.
- Meet de prostaat lengte van basis tot Apex, met behulp van een liniaal, en vergelijk met prostaat lengte zoals gemeten door MRI. Als de prostaat is gekrompen, een ad hoc correctie toepassen op de verwachte afstand van basis tot doel dwarse segment. Bijvoorbeeld, als de volledige lengte van de prostaat in het MRI-beeld is 50 mm, maar wanneer gemeten met een liniaal op dit punt het heeft gekrompen tot 45 mm, verminderen de verwachte snijden positie met 10%.
- Meet van de basis tot de gewenste dwarsdoorsnede. Kies de speld die zich het dichtst bij deze meting bevindt om rond te snijden.
- Het dragen van Chainmail handschoenen om letsel te voorkomen, houden snijden apparaat (Figuur 1B), plaats bladen aan weerszijden van de geïdentificeerde PIN en gebruik de Spacer om messen 5 mm uit elkaar te houden. Neem de snijbladen langzaam en stevig naar beneden, vooruit en achteruit met lange slagen (Figuur 1C). Zorg ervoor dat een volledig segment is gescheiden vóór demontage van apparatuur.
- Verwijder wanden en pennen en neem voorzichtig de slice uit op een steriele plaat van kurk karton met behulp van handschoenen.
6. weefsel bemonstering
- Inspecteer het dwarse segment visueel en vergelijk het met het axiale MRI-beeld. In sommige gevallen, het tumor gebied kan lijken bleker dan omringende weefsel.
- De dwarsdoorsnede zachtjes palperen. In sommige gevallen kan de tumor stevigere voelen dan het omringende weefsel.
- Gebruik de axiale MRI-afbeelding als een gids, selecteer een of meer gebieden voor bemonstering.
-
Neem biopsie stoten van het gewenste gebied van weefsel.
- Gebruik een 6 mm Punch, duw het gewenste gebied van het weefsel in.
- Draai de weefsel Punch ter plaatse en neer tegen de kurk om volledige scheiding te garanderen en gebruik een scherpe scalpel om indien nodig te scheiden.
- Verwijder de punch en plaats ze zo nodig in tubes/mallen door het uitwerpen met de zuiger.
- Herhaal voor verdere tumor en goedaardige monsters zoals vereist, met afzonderlijke steriele biopsie stoten. Inkt de gaten waar de ponsen in rood zijn genomen.
- Noteer de locatie van elke Punch samen met het gewicht van de prostaat en eventuele waarnemingen op weefsel kleur/stevigheid.
7. indiening van de prostaat voor lokale diagnostiek
- Speld de prostaat aan kurk met steriele naalden voor eenmalig gebruik voorafgaand aan fixatie om weefsel krimp en kromtrekken te voorkomen, wat het uiterlijk van de chirurgische marges zou kunnen veranderen.
- Na vastzetten op kurk, dient u de prostaat in bij de afdeling histopathologie voor standaard klinische diagnostiek.
8. ontsmetting van apparaten
- Gooi alle wegwerpmateriaal in biomedische afvalstromen en/of naaldencontainers zoals plaatselijk aangewezen.
- Ontsmet de laminaire stroom afzuigkap en de prostaat-snijapparatuur in overeenstemming met lokale risicobeoordelingen die geschikt zijn voor menselijk weefsel (bijv. door spuiten met 70% EtOH en Wiping).
Representative Results
Vers prostaatweefsel bemonsterd met behulp van de PEOPLE-methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan downstreamtechnieken, waaronder genomische sequencing en ex vivo-cultuur. De eerste 59 gevallen bemonsterd met behulp van deze methode zijn eerder gepubliceerd in vergelijking met een eerdere versie van de methode, samen met de initiële downstream gegevens8. De tijd vanaf het eerste snijden van de prostaat tot bevriezing/vaststelling van de punch biopsieën hier was ongeveer 1 min, die tot een minimum werd beperkt om afbraak van RNA te voorkomen. Tijd van het verwijderen van de prostaat naar prostaat snijden moet ook tot een minimum worden beperkt, hoewel dit ongeveer 20 minuten duurde vanwege onze theater-en pathologie-laboratoria op verschillende locaties.
Afhankelijk van de downstream toepassing, meestal ten minste twee monsters worden genomen: een van een gebied van verwachte tumorweefsel en een van een gebied van verwachte goedaardige weefsel. De belangrijkste maatstaf voor succes voor de bemonsteringsmethode zelf is het beoordelen van het tumor gehalte in een bepaald monster.
Voor binnenkomst in het 100.000 genomen-project moet een sectie van H & E gekleurd weefsel worden beoordeeld door een uropatholoog, en het monster moet ten minste 40% tumorcellen bevatten. Monsters die minder dan 40% tumor bevatten kunnen nog steeds worden opgenomen in het project als ze met succes macrodissected. Van de eerste 92 gevallen die op deze manier werden bemonsterd, bevatte 64% een tumor van ten minste 40% en werden zij aan het 100.000 Genomes-project voorgelegd zonder macrodissectie. DNA werd geëxtraheerd en was in alle gevallen van voldoende opbrengst en kwaliteit (tabel 1). Een eerste subset van 59 van deze voorbeelden werd eerder gepubliceerd in vergelijking met een eerdere methode8.
Voor ex vivo-cultuur moeten gematchte tumor en goedaardige weefsels van voldoende kwaliteit zijn om de cultuur van 72 uur te weerstaan zonder significante degradatie. Meerdere weefselmonsters van in totaal drie patiënten werden met succes gecultiveerde8.
Figuur 1: prostaat-snijden-apparatuur. Dit apparaat werd verkregen onder de Material Transfer Agreement van het Institute of Cancer Research. (A) de wanden loodrecht op de basis worden geplaatst, en gouden pinnen worden ingebracht in de basis rond de prostaat (prostaat niet afgebeeld). B) de verwisselbare parallelle messen worden in de hendel van de Blade gestoken. C) de messen passeren tussen de gouden pennen om een 5 mm-gedeelte van de prostaat te snijden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| n (%) | |
| Hit (> 40% tumor) | 59 (64%) |
| Partiële hit (5-30% tumor) | 6 (7%) |
| Miss (0% tumor) | 27 (29%) |
| Totale | 92 (100%) |
Tabel 1: tumor hit rate. Tumor hit rate werd bepaald door een consultant patholoog gespecialiseerd in prostaatkanker, na beoordeling van H & E gekleurd weefsel. Tumor celinhoud van > 40% werd vastgesteld om geschikt te zijn voor opname in het 100.000 Genomes project, volgens de Genomics England richtlijnen.
Discussion
Kritische stappen binnen dit protocol omvatten identificatie van tumor regio voor bemonstering, meting van de prostaat, en weefsel bemonstering. Ten eerste, meting van de MRI om het juiste gebied van de bemonstering te identificeren is de sleutel. We demonstreren deze methode in de begeleidende video; We raden u echter ook aan om in eerste instantie metingen te bevestigen met een radioloog. Duidelijke klinische nota's die wijzen op de onderzoeker naar het gebied van de MRI-beelden die de index laesie bevat zijn ideaal. Ten tweede moet de meting van de prostaat met zorg worden uitgevoerd, zodat de liniaal onder een hoek wordt gehouden om de volledige lengte van de basis tot de Apex te meten, parallel aan het voorste deel van de prostaat. Ten derde moeten tumor gebieden vóór de bemonstering worden bevestigd door het weefsel segment visueel te inspecteren ten opzichte van het oorspronkelijke MRI-beeld, het weefsel te palperen (in sommige gevallen kan het tumor gebied meer dicht aanvoelen) en visueel de kleur van het weefsel beoordelen (in sommige gevallen zal de tumor meer bleek dan omringende goedaardig weefsel verschijnen).
Dit protocol is volledig uitgevoerd bij UCL/UCLH door niet-klinische postdoctorale onderzoekers, een pathologie-Fellow, pathologie consultants en onderzoekstechnici. In onze ervaring kunnen alle stappen van het protocol worden geleerd in minder dan tien gevallen, ongeacht de technische achtergrond. We raden echter aan om een radioloog te trainen met betrekking tot MRI-meting en training van een patholoog met betrekking tot snijden in de eerste instantie. Het protocol kan worden gewijzigd met behulp van een 3D gedrukte snijden handvat, zoals eerder gepubliceerd10.
Mogelijke beperkingen van de techniek zijn onder meer het risico van belemmering van de diagnose. Snijden van de prostaat is een belangrijke stap, die zou kunnen belemmeren bij het beoordelen of positieve marge tarieven als onjuist gedaan. Er zijn twee mogelijke problemen. Ten eerste, als alle index laesies worden verwijderd en onmiddellijk worden gebruikt voor het experimenteren met verse weefsels, zal routinematige klinische diagnostiek niet worden uitgevoerd voor deze laesie en kan de patiënt verkeerd worden gediagnosticeerd als een lagere graad van kanker. Om dit te voorkomen, moet de onderzoeker het bemonsteringsplan bespreken met de consultant-patholoog die de zaak regelmatig zal beoordelen, voorafgaand aan de bemonstering, en het aantal en de locatie van de te nemen monsters overeenkomen. Kleine tumoren kunnen om deze reden lokaal worden uitgesloten. Ten tweede, als de prostaat capsule niet correct is vastgemaakt aan het kurk bord voorafgaand aan de fixatie, kan dit het binnenste weefsel naar buiten uitpuven tijdens fixatie, waardoor de chirurgische marges veranderen. Dit kan leiden tot een valse positieve marge, waarbij de overgebleven tumor lijkt te wonen in de capsule puur als gevolg van weefsel kromtrekken.
De betekenis van deze techniek met betrekking tot bestaande methoden ligt voornamelijk bij tumor targeting. Tot op heden is een reeks methoden voor het bemonsteren van radicale prostatectomie-specimens gepubliceerd; Deze zijn echter allemaal afhankelijk van een volledig of gedeeltelijk steekproefsgewijze benadering1,2,3,4,5,6,7. Het gebruik van biopsie en in het bijzonder MRI-gegevens hier heeft verbeterde efficiëntie, waardoor voor verminderde bemonstering met meer vertrouwen van het verkrijgen van tumorweefsel8.
Toekomstige toepassingen van deze methode maken het mogelijk een breder scala aan downstreamtechnieken te gebruiken dan met eerdere bemonsteringsmethoden. Bijvoorbeeld, de beschikbaarheid van vers weefsel dat een hoge waarschijnlijkheid van tumor zijn betekent dat duurdere en/of arbeidsintensieve verse weefsel technieken kunnen worden gebruikt, omdat veel monsters niet nodig zijn om de aanwezigheid van tumor te waarborgen. Dit kan omvatten en is niet beperkt tot, ex vivo cultuur, ex vivo MRI, Advanced Imaging en transcriptomics.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen prostaatkanker VK erkennen voor de financiering van SH onder het Centre of Excellence van prostaatkanker in het VK en de reizende prijs Gemeenschap (TLD-PF16-004) en HP onder INNOVEER (PG14-018-TR2). Dit werk werd gesteund door onderzoekers van het National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 mm biopsy punch | Fisher Scientific | 13404607 | Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples |
| Black Ink | Leica Biosystems | 3801753 | Tissue marking & margin dye |
| Blue Ink | Leica Biosystems | 3801751 | Tissue marking & margin dye |
| Chainmail hand glove | Arco | 1456803 | Chainmail gloves to protect hand during slicing |
| Cork board | Fisher Scientific | 12396447 | Cork board for pinning prostate to following sampling procedure |
| Needles | SLS (Scientific Laboratory supplies) | SYR6112 | Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling |
| Prostate slicing aparatus | Insitute of Cancer Research, London | NA - must be obtained under MTA | A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins |
References
- Sooriakumaran, P., Henderson, A., Denham, P., Langley, S. E. A novel method of obtaining prostate tissue for gene expression profiling. International Journal of Surgical Pathology. 17 (3), 238-243 (2009).
- Jhavar, S. G., et al. Processing of radical prostatectomy specimens for correlation of data from histopathological, molecular biological, and radiological studies: a new whole organ technique. Journal of Clinical Pathology. 58 (5), 504-508 (2005).
- Wheeler, T. M., Lebovitz, R. M. Fresh tissue harvest for research from prostatectomy specimens. The Prostate. 25 (5), 274-279 (1994).
- Esgueva, R., et al. Next-generation prostate cancer biobanking: toward a processing protocol amenable for the International Cancer Genome Consortium. Diagnostic Molecular Pathology. 21 (2), 61-68 (2012).
- Dev, H., et al. Biobanking after robotic-assisted radical prostatectomy: a quality assessment of providing prostate tissue for RNA studies. Journal of Translational Medicine. 9, 121 (2011).
- Tolkach, Y., et al. Blind Biobanking of the Prostatectomy Specimen: Critical Evaluation of the Existing Techniques and Development of the New 4-Level Tissue Extraction Model With High Sampling Efficacy. The Prostate. 77 (4), 396-405 (2017).
- Warren, A. Y., et al. Method for sampling tissue for research which preserves pathological data in radical prostatectomy. The Prostate. 73 (2), 194-202 (2013).
- Heavey, S., et al. PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch, a tissue collection pathway utilizing magnetic resonance imaging data to target tumor and benign tissue in fresh radical prostatectomy specimens. The Prostate. 79 (7), 768-777 (2019).
- Bailey, C., et al. VERDICT MRI validation in fresh and fixed prostate specimens using patient-specific moulds for histological and MR alignment. NMR in Biomedicine. 32 (5), 4073 (2019).
- Bourne, R. M., et al. Apparatus for Histological Validation of In Vivo and Ex Vivo Magnetic Resonance Imaging of the Human Prostate. Frontiers in Oncology. 7, 47 (2017).
