تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس
Summary
ترجمة تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP) تمكن العزل السريع والفعال للخلية نوع محدد ترجمة mRNA. هنا، نقوم بشرح طريقة تجمع بين حقن الوريد الخلفي الهيدروديناميكي في نموذج الماوس لإعادة السكان الكبد وTRAP لدراسة ملف تعريف التعبير عن إعادة ملء خلايا الكبد.
Abstract
إعادة سكان الكبد بعد الإصابة هي سمة حاسمة من سمات الثدييات التي تمنع الفشل الفوري للأعضاء والوفاة بعد التعرض للسموم البيئية. ويمكن أن يساعد الفهم الأعمق للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إعادة التجمعات السكانية في تحديد الأهداف العلاجية لتعزيز استعادة وظيفة الكبد في تحديد الإصابات. ومع ذلك، فإن أساليب عزل خلايا الكبد المعاد إسكانها على وجه التحديد تمنعها عدم وجود علامات الخلايا، وأرقام الخلايا المحدودة، وهشاشة هذه الخلايا. تطوير ترجمة تكنولوجيا تنقية التقارب الريبوسوسوم (TRAP) جنبا إلى جنب مع نموذج فاه-/- الماوس لتلخيص إعادة السكان في وضع إصابة الكبد يسمح بتوصيف التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد. مع TRAP، يتم عزل mRNA ترجمة نوع الخلية بسرعة وكفاءة. قمنا بتطوير طريقة تستخدم TRAP مع العزلة القائمة على التقارب من ترجمة mRNA من خلايا الكبد التي تعبر بشكل انتقائي عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسومة بروتين ريبوسومال (RP)، GFP:RPL10A. TRAP يتحايل على الفترة الزمنية الطويلة المطلوبة لفرز الخلايا المنشطة الفلورية التي يمكن أن تغير ملف تعريف التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، منذ فقط إعادة ملء خلايا الكبد التعبير عن GFP: RPL10A بروتين الانصهار، وmRNA معزولة خالية من التلوث من خلايا الكبد المصابة المحيطة بها وأنواع الخلايا الأخرى في الكبد. وmRNA تنقية التقارب هي ذات جودة عالية ويسمح المصب PCR- أو عالية الإنتاجية تحليل التسلسل القائم على التعبير الجيني.
Introduction
كما الجهاز الأيضي الرئيسي في الفقاريات، والكبد هو المسؤول عن التوازن الجلوكوز، تخليق بروتين المصل، إفراز حمض الصفراء، والتمثيل الغذائي xenobiotic وإزالة السموم. الكبد يملك قدرة غير عادية لتجديد parenchyma المصابة عند التعرض للسموم لمنع فشل الكبد الفوري1. ومع ذلك، يمكن أن يحدث فشل التجديد في إعداد الأسيتامينوفين أو الكحول الإفراط في الاستهلاك، والتي يمكن أن تؤدي إلى فشل الكبد الحاد2. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسبب إصابة الكبد المزمنة الناجمة عن عدوى التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية، والتهاب الكبد الدهني تليف الكبد، وتليف الكبد، وسرطان الكبد الخلوي3. العلاج العلاجي الوحيد المتاح لمرض الكبد في المرحلة النهائية هو زرع ولكن محدودة بسبب نقص الأعضاء، ومنع العلاج الفعال لجميع المرضى4. وبالتالي فإن التوصل إلى فهم أفضل لعملية التعافي بعد إصابة الكبد السامة أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات لتحفيز التجدد الكافي لإنقاذ وظيفة في الجهاز المريض.
نظام النموذج الأكثر تطبيقا على نطاق واسع لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي في القوارض ، حيث يتم استئصال نسبة كبيرة من الكبد لتحفيز التوسع السريع في خلايا الكبد5. ومع ذلك، استئصال الكبد الجزئي لا يلخص توسع خلايا الكبد بعد إصابة الكبد السامة بسبب عدم وجود تسلل الخلايا المناعية ونخر الخلايا الكبدية غالبا ما لوحظ في وضع إصابة الكبد الحادفي البشر6. وهناك نظام أكثر ملاءمة لنمذجة هذا الشكل من تجديد الأعضاء هو فاه-/- الماوس، الذي يفتقر إلى fumarylacetoacetate الهيدرولاز الوظيفية (FAH) المطلوبة لعملية التمثيل الغذائي التيروزين السليم ويتطور تلف الكبد الشديد مما يؤدي إلى الموت7. ويمكن الحفاظ على هذه الفئران في حالة صحية إلى أجل غير مسمى عن طريق العلاج مع نيتيزينون المخدرات في مياه الشرب. بدلا من ذلك، يمكن استعادة التعبير FAH عن طريق تسليم transgene إلى مجموعة فرعية من خلايا الكبد، والتي سوف تتوسع لإعادة ملء الكبد عند إزالة نيتيسينون8.
لتوصيف التغيرات في التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد، هناك حاجة إلى أداة لعزل خلايا الكبد المتماثلة على وجه التحديد في فاه-/- الماوس دون تلوث من خلايا الكبد المصابة المجاورة وأنواع الخلايا الأخرى. لسوء الحظ، فرز الخلايا بمساعدة الفلورة (FACS) من خلايا الكبد من الصعب منذ (1) هشاشة إعادة ملء خلايا الكبد يؤدي إلى الانتعاش الفقراء بعد التسريب الكبد، (2) تكرار خلايا الكبد هي متغيرة للغاية في الحجم، مما يجعل العزلة من السكان نقية من قبل FACS صعبة، و (3) وقت الإجراء من التسريب الكبد لعزل الحمض النووي الريبي هو أكبر من 2 ح، وبالتالي ملامح التعبير الجيني قد تخضع لتغييرات اصطناعية كبيرة قبل الحصول على عينات9.
بدلا من ذلك، فإن التعبير عن ريبوسوسومات ذات علامات النعوت على وجه التحديد في إعادة ملء خلايا الكبد يسمح للعزل السريع من ترجمة بنشاط mRNA ملزمة الريبوسوسوم باستخدام تنقية التقارب مباشرة بعد حصاد الأعضاء، مع الكبد السائبة الأنسجة lysates. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتنفيذ ترجمة الريبوسوم تنقية التقارب (TRAP)10 تليها عالية الإنتاجية RNA-التسلسل (TRAP-seq)، لعزل على وجه التحديد والملف الشخصي mRNA في إعادة ملء خلايا الكبد في Fah-/- الماوس9. التعبير المشترك للبروتين الفلورسنت الأخضر الموسومة ريبوسومال (GFP: RPL10A) مع FAH يسمح تنقية تقارب ترجمة mRNA ملزمة polysomes التي تحتوي على GFP: RPL10A. يتفادى هذا الأسلوب أي خطوات تفكك الخلايا، مثل التسريب الكبد لعزل الخلايا الكبدية الهشة. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم lysis من أنسجة الأعضاء كلها والأجسام المضادة لاستخراج بسرعة الحمض النووي الريبي على وجه التحديد من الخلايا المستهدفة. وأخيراً، فإن عزل الميرنا الوفيرة وعالية الجودة عن طريق TRAP-seq يمكّن التطبيقات النهائية مثل تحليل التسلسل من تحديد التغير الديناميكي في التعبير الجيني أثناء عملية إعادة السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seq هو تقنية لعزل نوع الخلية محددة من ترجمة mRNA عن طريق ريبوسوسومات ذات علامات النعت، ويقدم بديلا لنهج FACS، كما أنه يتحايل على القيود مثل متطلبات الوقت من FACS9. بدلا ً من ذلك، يسمح TRAP بعزل الحمض النووي الريبي بسرعة وكفاءة مباشرة من الأنسجة السائبة، مما يساعد على تجنب أي تغييرات ف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: F31-DK113666 (AWW)، K01-DK102868 (AMZ)، K08-DK106478 (KJW)، و P30-DK050306 (منحة تجريبية إلى KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
