Vitrification en vrac de gouttelette pour la conservation primaire d'hépatocyte

Reinier  J. de Vries; Peony  D. Banik; Sonal Nagpal; Lindong Weng; Sinan Ozer; Thomas  M. van Gulik; Mehmet Toner; Shannon  N. Tessier; Korkut Uygun

doi:10.3791/60250

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Article de méthode

Vitrification en vrac de gouttelette pour la conservation primaire d'hépatocyte

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DOI :

10.3791/60250

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25 octobre 2019

Reinier J. de Vries¹^,²^,³ , Peony D. Banik¹^,² , Sonal Nagpal¹^,² , Lindong Weng¹^,² , Sinan Ozer¹^,² , Thomas M. van Gulik³ , Mehmet Toner¹^,² , Shannon N. Tessier¹^,² , Korkut Uygun¹^,²

¹Center for Engineering in Medicine, Harvard Medical School, Massachusetts General Hospital, ²Shriners Hospitals for Children, Boston, ³Department of Surgery, University of Amsterdam

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode de cryoconservation sans glace pour de grandes quantités d'hépatocytes de rat par laquelle les cellules primaires sont pré-incubées avec des agents cryoprotecteurs à une faible concentration et vitrifiées dans de grandes gouttelettes.

Résumé

La vitrification est une solution de rechange prometteuse sans glace pour la cryoconservation classique de la congélation lente (à environ 1 oC/min) des échantillons biologiques. La vitrification nécessite des taux de refroidissement extrêmement rapides pour assurer la transition de l'eau dans la phase de verre tout en évitant la formation de glace dommageable. Bien que la pré-incubation avec des agents cryoprotecteurs (CPA) puisse réduire le taux critique de refroidissement des échantillons biologiques, des concentrations élevées sont généralement nécessaires pour permettre la cryoconservation sans glace par vitrification. En conséquence, la vitrification est entravée par la toxicité cpA et limitée aux petits échantillons qui peuvent être refroidis rapidement. Il a été récemment démontré que ces limitations inhérentes peuvent être surmontées par la vitrification en vrac des gouttelettes. Utilisant cette nouvelle méthode, les cellules sont d'abord pré-incubées avec une faible concentration intracellulaire de CPA. Tirant parti de la déshydratation osmotique rapide, l'APC intracellulaire est concentré directement avant la vitrification, sans avoir besoin d'équilibrer complètement les concentrations toxiques de CPA. La déshydratation cellulaire est effectuée dans un dispositif fluide et intégrée à la génération continue à haut débit de grosses gouttelettes qui sont vitrifiées dans l'azote liquide. Cette méthode de cryoconservation sans glace avec une toxicité minimale de CPA convient aux grandes quantités de cellules et a comme conséquence la viabilité accrue d'hépatocyte et la fonction métabolique comparée à la cryoconservation lente-congélation classique. Ce manuscrit décrit en détail les méthodes de vitrification réussie des gouttelettes en vrac.

Introduction

La perte de la viabilité cellulaire et de la fonction métabolique après la cryoconservation des hépatocytes est toujours un problème majeur qui limite les applications cliniques¹^,²^,³. La méthode de référence de la cryoconservation des hépatocytes est la congélation lente, qui est effectuée en pré-incubant les hépatocytes avec CPA (sulfoxide de diméthyle [DMSO], glucose et albumine) et le gel contrôlé subséquent (à environ 1 oC/min) pour températures cryogéniques⁴^,⁵. Malgré de nombreuses optimisations signalées, la tox....